Microsoft Word tcsh14-027-Nguyen Duc Thanh Dzung edited doc
Các kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR
tải về 0.52 Mb. Chế độ xem pdf
|
| Các kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR
Với sự phát triển kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction-PCR) đã dẫn đến những tiến bộ vượt bậc trong việc cải tiến các kỹ thuật xây dựng các chỉ thị DNA dựa trên phản ứng PCR [123]. Các kỹ thuật chỉ thị DNA dựa trên phản ứng PCR, ngoài hai kỹ thuật sử dụng rộng rãi là RAPD và AFLP, dựa vào sự nhân bản các chuỗi hoặc vùng DNA khác nhau có thể chia ra một số nhóm như: kỹ thuật chỉ thị các chuỗi đặc trưng, kỹ thuật chỉ thị tiểu vệ tinh, kỹ thuật chỉ thị gen nhảy. Kỹ thuật đa hình DNA nhân ngẫu nhiên (RAPD) Cơ sở của kỹ thuật RAPD là sự nhân bản DNA genome bằng phản ứng PCR với các mồi ngẫu nhiên để tạo ra sự đa hình DNA do sự tái sắp xếp hoặc mất nucleotide ở vị trí bắt mồi [197].
Mồi sử dụng cho kỹ thuật RAPD là các mồi ngẫu nhiên, thường là 10 nucleotide và có nhiệt độ kéo dài mồi thấp (34-37 o C). Mặc dù trình tự mồi RAPD là ngẫu nhiên nhưng phải đạt được hai tiêu chí là: tỷ lệ GC tối thiểu phải là 40% (thường là 50-80%) và không có trình tự bazơ đầu xuôi và ngược giống nhau. Sản phẩm PCR- RAPD thường được phân tách trên gel agarose 1,5-2,0%. Kỹ thuật RAPD không cần thông tin về genome của đối tượng nghiên cứu và có thể ứng dụng cho các loài khác nhau với các mồi chung. Hơn nữa, kỹ thuật RAPD đơn giản và dễ thực hiện. Nhưng kỹ thuật RADP có hạn chế là sản phẩm PCR không ổn định do mồi ngắn, nhiệt độ bắt mồi thấp; ngoài ra, kỹ thuật này tạo ra các chỉ thị trội do đó không phân biệt được các cá thể dị hợp tử với các cá thể đồng hợp tử. RADP sử dụng nhiều trong nghiên cứu đa dạng di truyền giữa các loài thực vật [84, 85, 176, 177, 179, 180, 185], trong nghiên cứu đặc điểm của giống và đánh giá biến đổi di truyền [114], trong xác định loài [52, 153] và xác định con lai [10, 152]. Kỹ thuật PCR với các mồi ngẫu nhiên (Arbitarily Primed PCR-AP-PCR) và lấy dấu bằng nhân bản DNA (DNA amplification fingerprinting-DAF) là hai kỹ thuật được phát triển độc lập và là hai dạng biến thể của kỹ thuật RAPD. Đối với AP-PCR chỉ dùng một mồi đơn có độ dài 10 đến 15 nucleotide. Kỹ thuật được thực hiện khác với PCR bình thường là hai chu kỳ đầu được tiến hành ở điều kiện không chặt chẽ (nhiệt độ bắt mồi thấp) sau đó ở các chu kỳ sau PCR được tiến hành trong điều kiện chặt chẽ bằng việc tăng nhiệt độ bắt mồi. Trong trường hợp DAF thì chỉ sự dụng một mồi ngẫu nhiên ngắn hơn 10 nucleotide và sản phẩm PCR được phân tích bằng gel polyacrylamide. Với DAF, mồi sử dụng ngắn nhưng nồng độ mồi cần cao, phản ứng PCR gồm hai chu kỳ nhiệt chứ không phải ba chu kỳ như RAPD. Kỹ thuật AP- PCR khác với RAPD và DAF là: phản ứng PCR chia thành ba bước, mỗi bước có độ chặt chẽ và nồng độ của các thành phần phản ứng khác nhau. Nồng độ mồi ở những chu kỳ đầu cao, mồi dài 20 nucleotide hoặc hơn. Kỹ thuật đa hình độ dài đoạn nhân chọn lọc (Amplified Fragment Length Polymorphism- AFLP) Kỹ thuật AFLP được sử dụng để phát hiện đa hình DNA. Phân tích AFLP được kết hợp cả RFLP và PCR bằng việc gắn các chuỗi nhận biết vào mồi hay còn gọi là chuỗi tiếp hợp (adapter) để nhân chọn lọc các phân đoạn DNA được cắt hạn chế. Các cặp mồi thường tạo được từ 50 đến 100 băng trong một phân tích. Số lượng băng phụ thuộc vào số nucleotide chọn lọc trong tổ hợp mồi. Kỹ thuật AFLP cho phép lấy dấu DNA từ bất kỳ nguồn gốc nào.
|