Microsoft Word tcsh14-027-Nguyen Duc Thanh Dzung edited doc

 270 

bước  như  trong  hình  2:  đầu  tiên  DNA  genome 

được  cắt  bởi  enzyme  cắt  hạn  chế  cắt  không 

thường  xuyên  (EcoRI  hoặc  PstI)  và  cắt  thường 

xuyên  (MseI  hoặc  TaqI).  Các  phân  đoạn  tạo  ra 

sau  khi  cắt  hạn  chế  được  gắn  với  các  đoạn  kết 

nối  ở  cả  hai  đầu.  Các  đoạn  kết  hợp  này  được 

thiết  kế  sao  cho  vị  trí  nhận  biết  ban  đầu  của 

enzyme cắt hạn chế không khôi phục lại sau khi 

gắn.  Phản  ứng  PCR  chỉ  xảy  ra  khi  các  mồi  có 

thể  gắn  với  các  phân  đoạn  có  trình  tự  kết  nối 

cùng  với  các  cặp  bazơ  bổ  sung  với  các 

nucleotide  chọn  lọc.  Việc  nhân  bản  được  thực 

hiện  hai  lần  trong  điều  kiện  chặt  chẽ  với  các 

mồi  bổ  trợ  với  các  đoạn  tiếp  hợp  và  1  đến  3 

nucleotide chọn lọc ở đầu 3’. Phản ứng PCR lần 

đầu  (tiền  nhân)  được  tiến  hành  với  tổ  hợp  mồi 

chứa  một  nucleotide  chọn  lọc.  Phản  ứng  PCR 

lần  hai  (nhân  chọn  lọc)  được  tiến  hành  với  các 

cặp mồi có 1 đến 3 nucleotide chọn lọc. Do mức 

độ  chọn  lọc  cao,  các  mồi  khác  nhau  chỉ  một 

nucleotide  sẽ  cho  các  bộ  phân  đoạn  nhân  bản 

khác  nhau.  Các  mồi  với  1,  2  và  3  nucleotide 

chọn  lọc  sẽ  giảm  số  phân  đoạn  được  nhân  bản 

tương  ứng  là  4,  16  và  64.  Số  nucleotide  chọn 

lọc  phù  hợp  thay  đổi  theo  kích  thước  genome 

của  loài.  Các  phân  đoạn  AFLP  được  phân  tách 

bằng  gel  polyacrylamide  kết  hợp  nhuộm  bạc 

(AgNO3) hoặc bằng máy giải trình tự tự động. 

Phân  tích  AFLP  không  dễ  như  RAPD 

nhưng hiệu quả hơn RFLP. Kỹ thuật này có một 

số  ưu  điểm  như:  có  độ  tin  cậy  và  lặp  lại  cao; 

không cần thông tin về trình tự DNA của cơ thể 

nghiên cứu; cho nhiều thông tin do có khả năng 

phân tích số lượng lớn locus đa hình với một tổ 

hợp  mồi  trên  một  gel  và  có  thể  cho  thấy  các 

locus đặc thù; các số liệu có thể lưu giữ trong cơ 

sở dữ liệu để so sánh. 

Bên  cạnh  các  ưu  điểm,  AFLP  có  một  số 

nhược  điểm  như:  phải  qua  nhiều  bước  mới  có 

kết quả; DNA cần phải sạch, không có các chất 

ức  chế  hoạt  động  của  enzyme  cắt  hạn  chế;  đòi 

hỏi  công  sức  và  giá  thành  cao.  Kỹ  thuật  tạo  ra 

chỉ  thị  trội,  không  phân  biệt  được  đồng  hợp  tử 

và dị hợp tử. 

AFLP  được  sử  dụng  trong  nghiên  cứu  lập 

bản đồ genome [14, 173], đa dạng di truyền [53, 

103,  176,  178]  và  quan  hệ  chủng  loại  giữa  các 

kiểu  gen có  mối quan  hệ  gần [69, 159], nghiên 

cứu  cấu  trúc  di  truyền  nguồn  gen  [8,  68]  và 

đánh  giá  phân  hóa  di  truyền  trong  quần  thể 

[186, 196]. 

 

Hình  2.  Các  bước  tiến  hành  kỹ  thuật  AFLP: 

cắt  được  gắn  với  đoạn  kết  nối  EcoRI  và  MseI, 

tiếp theo các đoạn cắt giới hạn có  gắn đoạn kết 

nối  được  nhân  bản  bằng  PCR  với  các  mồi 

nucleotide  (tiền  nhân),  sản  phẩm  PCR  nhận 

được  được  nhân  với  tổ  hợp  các  mồi  EcoRI  và 

MseI  có  thêm  1  đến  3  nucleotide  (nhân  chọn 

lọc),  sản  phẩm  PCR  chọn  lọc  được  phân  tách 

trên  gel  polyacrylamide  và  nhuộm  bạc  để  quan 

sát các băng.