Microsoft Word tcsh14-027-Nguyen Duc Thanh Dzung edited doc
tải về 0.52 Mb. Chế độ xem pdf
|
| Kỹ thuật vị trí chuỗi đánh dấu (Sequence-
tagged Sites-STS) Chuỗi vị trí đánh dấu (STS) là vùng ngắn trong genome (có độ dài 200-300 cặp bazơ) mà trình tự của nó không thể có ở bất cứ nơi nào khác trong genome. Chuỗi trình tự duy nhất này có thể nhân bản được bằng PCR. Trình tự DNA của STS có thể có các yếu tố lặp lại, và các trình tự xuất hiện bất cứ ở đâu trong genome, nhưng trình tự ở hai đầu của STS là duy nhất. Chúng ta có thể tổng hợp các mồi duy nhất bổ sung với trình tự ở hai đầu STS và nhân đoạn STS bằng PCR. Với nghĩa rộng, STS bao gồm các chỉ thị như microsatellites (SSRs, STMS or SSRPs), SCARs, CAPs và ISSRs. Kỹ thuật STS là sử dụng PCR để nhân chọn lọc vị trí đánh dấu (STS) bằng cặp mồi đặc hiệu gắn với hai đầu của chuỗi STS với điều kiện của phản ứng sao cho chỉ nhân được chuỗi STS đích mà không phải chuỗi nào khác trong genome.
Các kỹ thuật chỉ thị DNA
275 Sản phẩm PCR được phân tách trên gel agorose hoặc polyacrylamide. Ưu điểm của kỹ thuật STS là tạo ra các chỉ thị đồng trội, có thể phân biệt được dị hợp tử và có tính lặp lại cao vì các mồi sử dụng dài. Nhược điểm của kỹ thuật này là cần biết về trình tự vùng STS và cần đầu tư cho việc phát triển mồi đặc hiệu. STS được sử dụng cho nghiên cứu đa dạng di truyền [139], nhận biết gen [89], so sánh bản đồ [25], xác định gen liên kết [125], xác định độ thuần hạt lai [206] và đánh giá tính kháng bệnh [13].
Các kỹ thuật chỉ thị dựa trên phản ứng PCR khác Kỹ thuật các chuỗi đa hình nhân bản được cắt (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences- CAPS)
Kỹ thuật chỉ thị CAPS là giải pháp sử dụng các chuỗi DNA của chỉ thị RFLP đã được lập bản đồ để phát triển chỉ thị PCR nhằm tránh bước lai Southern phức tạp. Vì thế, kỹ thuật CAPS còn được gọi là kỹ thuật PCR-RFLP [93]. Kỹ thuật CAPS được tiến hành bằng cắt hạn chế sản phẩm PCR của các locus đặc thù với một hoặc nhiều enzyme cắt hạn chế và phân tách các đoạn DNA được cắt trên gel agarose hoặc polyacrylamide. Các cặp mồi được thiết kế dựa trên thông tin về trình tự của DNA hoặc cDNA trên ngân hàng gen hoặc trình tự các băng RAPD được tách dòng. Chỉ thi CAPS là chỉ thị đồng trội và là các locus đặc thù được dùng để phân biệt đồng hợp tử và dị hợp tử ở các loài thực vật [93]. Kỹ thuật CAPS có hạn chế vì sự đột biến có thể làm mất hoặc tạo thêm các vị trí nhận biết của các enzyme cắt hạn chế. Để khắc phục hạn chế này, Michae & Amasino (1998) [118] đưa ra kỹ thuật biến thể khác gọi là dCAPS. Trong phân tích dCAPS, vị trí nhận biết của enzyme cắt hạn chế có SNP được đưa vào sản phẩm PCR bằng mồi chứa một hoặc nhiều điểm bất hợp (mis-match) với khuôn DNA. Sản phẩm PCR cải tiến này sau đó được cắt bằng enzyme cắt hạn chế và sự có mặt hay vắng mặt của SNP được xác định bằng mẫu cắt hạn chế tạo ra. CAPS và dCAPS là phương pháp xác định SNP cắt sản phẩm PCR đặc biệt bằng các enzyme cắt hạn chế. Đây là kỹ thuật rễ thực hiện, ít tốn kém so với bất kỳ phương pháp nào. Kỹ thuật này rất hữu ích cho việc theo dõi các đột biến đã biết trong quần thể phân ly [128] và để phát triển chỉ thị, đặc biệt là chỉ thị SNP liên kết với gen/QTL phục vụ cho chọn giống [40, 100]. tải về 0.52 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|