Microsoft Word tcsh14-027-Nguyen Duc Thanh Dzung edited doc
tải về 0.52 Mb. Chế độ xem pdf
|
| Kỹ thuật đa hình các chuỗi liên quan được nhân
bản (Sequence-Related Amplified Polymorphism-SRAP) Kỹ thuật SRAP [102] là kỹ thuật nhân bản các khung đọc mở (ORFs). Trong kỹ thuật này dùng hai mồi ngẫu nhiên có độ dài 17 đến 21 nucleotide và giàu AT hoặc GC để nhân phân đoạn bên trong gen cho đa hình đã được xác định. Các mồi cấu tạo bởi các thành phần: các chuỗi lõi (core primers) với 13-14 nucleotide, trong đó 10 -11 nucleotide đầu bắt đầu từ đầu 5’ là trình tự không đặc thù (hay còn gọi là chuỗi rời) tiếp theo là các trình tự CCGG cho mồi xuôi và AATT cho mồi ngược. Các mồi lõi được gắn với ba nucleotide chọn lọc ở đầu 3’. Chuỗi rời của mồi ngược và xuôi phải khác nhau và có thể dài 10-11 nucleotide. Năm chu kỳ đầu với nhiệt độ kéo dài mồi là 35 o C, 35 chu kỳ thiếp theo nhiệt độ kéo dài mồi là 50 o C. Các phân đoạn DNA nhân bản được phân tích bằng gel acrylamide biến tính. Kỹ thuật SRAP kết hợp sự đơn giản, độ tin cậy và dể dàng đọc trình tự các băng chọn lọc. SRAP hướng tới chuỗi mã hóa trong hệ gen tạo ra các chỉ thị đồng trội. Đa hình các chuỗi nhân bản tạo nên do hai sự kiện là sự thay đổi độ dài phân đoạn DNA do bổ sung hoặc mất nucleotide tạo ra chỉ thị đồng trội và sự thay đổi nucleotide tạo ra chỉ thị trội. SRAP được dùng để lập bản đồ [34, 106, 166] và nghiên cứu đa dạng di truyền [59, 163].
Đa hình cấu tạo sợi đơn là kỹ thuật cải tiến phân tích sự thay đổi vị trí của các chuỗi DNA đơn trên điện di gel polyacrylamide trung tính để xác định đa hình tạo nên bởi sự cuốn khác nhau của sợi đơn DNA do các thay đổi khó thấy trong chuỗi nucleotide [136]. Phân tích SSCP là công cụ mạnh cho việc đánh giá sản phẩm PCR phức tạp khi hai sợi DNA từ cùng sản phẩm PCR thường chạy tách rời trên SSCP gel, vì thế, có hai khả năng ghi nhận đa hình và giải quyết vấn đề đa hình bên trong chuỗi của sản phẩm Nguyen Duc Thanh 276
PCR từ vùng giống hệt nhau trong hệ gen của các cá thể nghiên cứu. Nguyên lý của phương pháp phân tích SSCP là dựa trên thực tế: sợi đơn DNA có cấu tạo nhất định. Thay đổi cấu tạo bằng sự thay đổi một nucleotide sẽ làm cho sợi đơn DNA chuyển động khác đi trong điều kiện điện di trên gel không biến tính. Vì thế, mẫu nguyên thủy và mẫu đột biến sẽ có mẫu điện di đồ khác nhau. Phân tích SSCP được tiến hành theo các bước: i. nhân bản PCR chuỗi DNA quan tâm, ii. biến tính sản phẩm PCR, iii. làm lạnh chuỗi DNA biến tính để tạo sợi đơn, iiii. xác định sự di chuyển khác nhau giữa các sợi đơn trong điều kiện điện di trên gel không biến tính. Có thể quan sát sự khác nhau bằng đánh dấu phóng xạ, nhuộm bạc, bằng các mồi PCR được đánh dấu bằng mầu huỳnh quang và điện di mao quản. PCR-SSCP là kỹ thuật nhanh, đơn giản, nhạy dùng cho xác định các đột biến bổ sung, thêm vào và bớt đi nucleotide trong phân đoạn DNA được nhân bản. Đây là công cụ quan trọng cho phân tích gen đặc biệt là xác định đột biến điểm. Kỹ thuật này giống kỹ thuật RFLP vì nó có thể giải đoán những thay đổi allen của các tính trạng di truyền. Khác với RFLP là SSCP có thể xác định được đa hình DNA và đột biến ở nhiều chỗ trong phân đoạn DNA. PCR-SSCP huỳnh quang là dạng kỹ thuật thích ứng của SSCP trong đó sự nhân bản chuỗi DNA đích được tiến hành với mồi đánh dấu huỳnh quang. Sự hạn chế của kỹ thuật SSCP là việc xây dựng chỉ thị SSCP mất nhiều công sức, đắt và không tự động hóa được. Kỹ thuật SSCP được xây dựng để xác định đột biến [136] sau đó được sử dụng để xác định biến đổi của chuỗi DNA [162] và nhân dòng gen [204]. tải về 0.52 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|