Microsoft Word tcsh14-027-Nguyen Duc Thanh Dzung edited doc
tải về 0.52 Mb. Chế độ xem pdf
|
| Kỹ thuật phân tích vị trí cắt hạn chế DNA lục
lạp (RFLP cpDNA) Nguyen Duc Thanh 278
Phân tích cắt hạn chế DNA lục lạp (cpDNA) được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu các loài và các biến đổi trong loài. Phân tích sự thay đổi độ dài các đoạn cắt hạn chế cpDNA là phương pháp đầu tiên trong phân tích cpDNA cho mục đích nghiên cứu phát sinh loài. Phương pháp phân tích cắt hạn chế cpDNA bao gồm phương pháp đơn giản như so sánh toàn bộ các đoạn cắt hạn chế genome lục lạp trên gel agarose đến lập bản đồ so sánh trực tiếp các vị trí cắt hạn chế bằng lai Southern. Phân tích điểm cắt hạn chế cpDNA có nhiều ưu việt trong nghiên cứu phát sinh loài: i- kỹ thuật đơn giản so với nhiều kỹ thuật phân tử khác; ii- hệ gen lục lạp đủ lớn để có thể có được nhiều vị trí cắt cho một enzyme; iii- các vị trí cắt hạn chế thể hiện gần như mẫu ngẫu nhiên của cpDNA; iv- các thay đổi mang thông tin phả hệ xảy ra ở các vị trí nằm trên vùng không mã; v- phân tích điểm cắt hạn chế không bị ảnh hưởng bởi sự nhiễm như đối với giải mã sản phẩm PCR. Tuy nhiên, do tính bảo thủ của cpDNA nên các loài gần nhau thường khó có đa hình. Phân tích vị trí cắt giới hạn cpDNA cũng được thực hiện trên các chuỗi gen (matK, atpB, ndhF, rbcL), các vùng không mã (ndhF và trnL intron) và các vùng đệm giữa các gen lục lạp (trnH-trnK, psbC-trnS, trnD-trnS,
phẩm PCR nhân bản các gen và các vùng này bằng các enzyme cắt hạn chế. Phương pháp này còn được biết đến là phương pháp PCR-RFLP cpDNA. Phân tích vị trí cắt hạn chế là phương pháp so sánh gián tiếp sự thay đổi trong genome. Để so sánh trực tiếp cần tiến hành đọc trình tự gen sau đó so sánh.
Phân tích cắt hạn chế cpDNA được sử dung trong nghiên cứu tiến hóa, phân loại, địa sinh học [133], nghiên cứu đa dạng di truyền và biến đổi cpDNA [141, 174, 176, 177, 180].
Các RNA vận chuyển (tRNAs) lục lạp là các đại phân tử cổ đã tiến hóa dưới các áp lực môi trường như các yếu tố thích ứng trong sự chuyển đổi ở tất cả các dạng sống, nhưng cũng dẫn tới các thay đổi cấu trúc và chức năng. Nói cách khác tRNAs rất đa dạng về vai trò (tổng hợp thành tế bào, tổng hợp porphyrin cho chlorophyll, biến đổi đầu N của protein, khởi động phiên mã ngược, tái mô hình hóa lipid trong sự bổ sung vào tổng hợp protein phụ thuộc ribosome) và cấu trúc. Một đặc điểm của các vùng tRNA là rất bảo thủ và vì thế cho phép những thay đổi cấu trúc dưới dạng thay thế, thêm bớt nucleotide (indel-insertion and deletion) và chuỗi lặp lại. Những thay đổi này cung cấp những thông tin quan trọng về sự tiến hóa.
Trong phân tích các RNA vận chuyển, các công trình nghiên cứu thường sử dụng các vùng đệm giữa các gen, đặc biệt là giữa hai gen trnL-
dài nhỏ hơn 500 bp. Từ vùng bảo thủ, hai mồi đã được thiết kế để nhân vùng đệm này ở các loài [167]. Với các mồi chung này và mức độ đa hình cao trong vùng đệm trnL-trnF làm cho vùng này trở thành chỉ thị tốt cho nghiên cứu phân tích ở nhiều loài thực vật [32]. Các trình tự khác nhau giữa các loài trong vùng đệm này có thể xác định bằng điện di trên gel polyacrylamide, phản ứng PCR-SSCP hoặc thậm trí điện di trên gel agarose. Ngoài vùng đệm giữa gen trnL-trnF, một số vùng đệm khác như các vùng đệm giữa các gen trnH-trnK,
dụng [129]. Các vùng không mã (intron) của gen trnL (UAA) cũng được sử dụng nhiều cho phân tích tiến hóa thực vật và cho phát triển chỉ thị để xác định thực vật cho gen là mẹ ở cơ thể đa bội cùng với khả năng khám phá quan hệ tiến hóa của các loài liên quan [205]. Kỹ thuật Simple sequence repeats lục lạp (cpSSR) SSR lục lạp (cpSSR) hay tiểu vệ tinh lục lạp (chloroplast microsatelitte) được tìm thấy trong tất cả các hệ gen lục lạp đã được giải trình tự hoàn toàn và hàng trăm trình tự lục lạp chưa được giải trình tự hết. Việc nhân bản bằng PCR các cpSSR này bằng các mồi đặc thù với các vùng nằm bên đầu 5’ và đầu 3’ đã tạo ra các sản phẩm có độ dài khác nhau tương ứng với vùng cpSSR. SSR lục lạp (cpSSR) khác với SSR nhân (nSSR) ở chỗ cpSSR cấu tạo bởi kiểu nucleotide đơn lặp lại từ 8 đến 15 lần. cpSSR tiến hóa nhanh hơn các vùng gen khác trong hệ gen lục lạp [75] và được xác định ở nhiều loài cây. Cho đến nay, các nghiên cứu cho thấy
Các kỹ thuật chỉ thị DNA
279 cpSSR cho mức độ đa hình cao hơn phân tích cắt hạn chế cpDNA (RFLP-cpDNA) [142]. Hệ gen lục lạp được di truyền với nhiều bản sao trong phân chia mitos và meios, vì vậy, nó trở thành đối tượng nghiên cứu phân hóa do trôi gen trong cấu trúc di truyền và trôi gen ngoài tự nhiên [65] và để xác định sự suy giảm đa dạng di truyền [116]. Di truyền theo mẹ, đơn bội, và bản chất không tái tổ hợp của hệ gen lục lạp làm nó trở thành phương tiện hữu hiệu trong nghiên cứu tiến hóa. cpSSR đã được sử dụng trong nghiên cứu nhiều loài cây như lúa, lúa mạch, thông, gõ đỏ v.v. [45, 142,143, 180]. Kỹ thuật phân tích trình tự cpDNA Trình tự DNA cung cấp công cụ cho phân tích so sánh trực tiếp. Tiêu chí chọn trình tự DNA cho phân tích bao gồm: i. trình tự phải đủ dài để có đủ thông tin về tiến hóa di truyền các vị trí nucleotide, ii. mức độ đa dạng phù hợp với vấn đề tiến hóa di truyền được đặt ra, theo Ritland và Clegg [151] mức độ đa dạng từ 5 đến 15% là phù hợp, mức độ này cung cấp đủ số lượng đặc điểm cần thiết. Phân tích trình tự cpDNA có ưu điểm là cần rất ít cpDNA khuôn. Để phân tích trình tự cpDNA, cũng giống như phân tích trình tự DNA nói chung, trước hết là nhân các gen, vùng gen hay vùng đệm các gen lục lạp bằng các mồi đặc hiệu, sau đó có thể nhân dòng trước khi đọc trình tự hoặc đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR. Cuối cùng là so sánh trình tự bằng các phần mềm chuyên dụng. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng trình tự gen rbcL cho nghiên cứu phân loại và tiến hóa loài [132] một số khác sử dụng trình tự gen ndhF [55] và gen matK [91]. Trình tự các chuỗi vùng đệm giữa các gen hay trình tự các chuỗi không mã của các gen hoặc giữa hai gen (trnL (UAA),
tự các vùng gen rbcL, matK, atpF-atpH IGS, psbK-psbI IGS và trnH-psbA IGS còn được dùng cho mã vạch (barcode) ở các loài lan [87]. tải về 0.52 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|