Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu
Kết quả nhân bản gen với các cặp mồi nghiên cứu
tải về 477.37 Kb.
|
- Điều hướng trang này:
- 3.3.2. Kết quả nhân bản gen rpoB
- 3.3.3 Kế quả nhân bản gen psbA-trnH
- 3.3.4. Kết quả nhân bản gen ITS
- 3.4. Kết quả tách dòng gen
- 3.4.2. Kết quả chuyển gen vào vector tách dòng
- 3.4.3. Kêt quả biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E. coli
- 3.4.4 Kết quả chọn lọc dòng tế bào mang gen tái tổ hợp
- 3.4.5. Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp
- 3.4.6. Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp
3.3. Kết quả nhân bản gen với các cặp mồi nghiên cứu3.3.1. Kết quả nhân bản gen rbcLrbcL là trình tự gen nằm trong lục lạp có thể nhân bản một cách dễ dàng ở nhiều loài thực vật. Ở các loài khác nhau kích thước của gen này cũng khác nhau, đối với cây dó bầu gen rbcL có kích thước khoảng 750 bp. Kết quả kiểm tra sản phẩm điện di gen rbcL trên gel agarose 0,8% (hình 3.3) cho thấy gen rbcL được khuếch đại tốt ở tất cả các mẫu dó bầu nghiên cứu, các băng thu được đều sáng và rõ chỉ có một băng vạch duy nhất với kích thước khoảng 750 bp (khi so sánh với thang DNA chuẩn 1kb). Đây kết quả tốt tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.  
750 bp Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen rbcLcủa các mẫu dó bầu nghiên cứu M : thang Marker1Kb; AL2,AL6,AL8,G1,Qx,M1, PQ64, T, T2,T3, T4, T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14 : Các mẫu dó bầu nghiên cứu
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen rpoB của các mẫu dó bầu nghiên cứu M : thang Marker1Kb; AL2,AL6,AL8,G1,Qx,M1, PQ64, T, T2,T3, T4, T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14 : Các mẫu dó bầu nghiên cứu Kết quả trên bản điện di cho thấy các băng đều sáng rõ và chỉ có một băng vạch duy nhất với kích thước khoảng 500 bp đúng như kích thước dự đoán ban đầu ở tất cả các mẫu nghiên cứu (hình 3.4). 3.3.3 Kế quả nhân bản gen psbA-trnHGen trnH-psbA có kích thước trung bình khoảng 450 bp, nhưng thay đổi từ 296 đến 1120 bp. trnH-psbA có khả năng xác định loài cao. Locus trnH-psbA đã khuếch đại thành công ở nhiều thực vật hạt kín và hạt trần, dương xỉ, rêu. Với các mẫu dó bầu nghiên cứu gen psbA-trnH có kích thước vào khoảng 450 bp (hình 3.5)  
450 bp Hình 3.5.Kết quả điện di sản phẩm PCR gen psbA-trnH của các mẫu dó bầu nghiên cứu M : thang Marker1Kb; AL2,AL6,AL8,G1,Qx,M1, PQ64, T, T2,T3, T4, T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14 : Các mẫu dó bầu nghiên cứu
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen ITS của các mẫu dó bầu nghiên cứu M : thang Marker1Kb; AL2,AL6,AL8,G1,Qx,M1, PQ64, T, T2,T3, T4, T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14 : Các mẫu dó bầu nghiên cứu
3.4.1 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR (thôi gel)Sản phẩm PCR thu được sau phản ứng khuếch đại gen có các tạp chất như mồi, đệm PCR, các nucleotide,...còn dư, và đôi khi có thể chứa các sản phẩm phụ sẽ ảnh hưởng đến kết quả của quá trình tách dòng, do vậy cần tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR trước khi tiến hành quá trình đưa gen vào vector tách dòng. Việc tinh sạch được thực hiện bằng bộ Kit AccuPrep Gel Purification Kit. Nguyên lý của phản ứng và quy trình thực hiện được nêu ở mục 2.2.2.3. Các đoạn gen sau khi tinh sạch được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0.8% để kiểm tra chất lượng và xác định sơ bộ hàm lượng DNA tinh sạch, kết quả thể hiện ở hình 3.7  
500 bp Hình 3.7. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR gen rpoB M : thang Marker1Kb; AL2,AL6,AL8,G1,Qx,M1, PQ64, T, T2,T3, T4, T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14 : Các mẫu dó bầu nghiên cứu Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch ở hình 3.7 cho thấy chỉ có một băng vạch có kích thước tương ứng với đoạn gen được nhân lên bằng mồi barcode tương ứng. Các băng vạch rõ nét chứng tỏ các DNA không bị đứt gãy trong quá trình tinh sạch, có thể tiến hành phản ứng ghép nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng tiếp theo. Tương tự với các sản phẩm PCR của các gen còn lại cũng đã được tiến hành tinh sạch và cho kết quả tốt tương tự gen rpoB.
Hình 3.8. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến Hình 3.8 cho thấy kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến có kết quả tốt, trên đĩa nuôi cấy xuất hiện những khuẩn lạc xanh và trắng mật độ và số lượng tương đối lớn đủ để qúa trình chọn lọn khuẩn lạc diễn ra dễ dàng (hình 3.8).
Để chọn lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp chúng tôi không sử dụng các cặp mồi đã nhân bản bằng phản ứng PCR (rbcL, rpoB, ITS và psbA - trnH) vì khi thực hiện phản ứng ghép nối sản phẩm PCR đã được sử dụng một lượng lớn do vậy ngoài những đoạn DNA quan tâm đã được gắn vào vector pBT vẫn còn rất nhiều đoạn DNA dư thừa, chúng tồn tại bên trong hoặc xung quanh các khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch khi biến nạp. Do đó khi tiến hành phản ứng clony - PCR với 4 cặp mồi trên chúng ta có thể vẫn thu được các băng vạch có kích thước quan tâm tuy nhiên thực tế các đoạn DNA của chúng ta lại chưa được biến nạp vào tế bào E.coli. 
Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR - clony khuẩn lạc mồi rbcL M : thang Marker 1Kb; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 : Các khuẩn lạc. Mồi pUC18 được thiết kế nằm trên vector pBT và ở hai phía đối với đoạn cắt đa điểm. Khoảng cách giữa 2 mồi trên vector vào khoảng 200 bp. Do đó khi tiến hành phản ứng clony - PCR các khuẩn lạc trắng do vector tự đóng vòng sẽ thu được băng có kích thước khoảng 200 bp, còn với plasmid tái tổ hợp còn các plasmid tái tổ hợp nhận được đoạn gen sẽ có kích thước bằng kích thước gen cộng thêm 200 bp. Mồi rbcL nhân lên đoạn gen barcodes có kích thước vào khoảng 750 bp, kết quả điện di trên hình 3.8 xuất hiện các băng vạch duy nhất có kích thước vào khoảng hơn 900 bp. Như vậy bước đầu cho thấy các dòng khuẩn lạc đều mang gen quan tâm trừ dòng số 1, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 12, 17, 24 vì những dòng khuẩn lạc này không có băng vạch chúng ta quan tâm. Các mồi còn lại cũng được tiến hành tương tự và đã thu được các dòng khuẩn lạc mang gen cần quan tâm. 3.4.5. Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợpSau khi các dòng khuẩn lạc chứa đoạn gen ở trên được lựa chọn sẽ được nuôi trong 3 ml môi trường LB lỏng có bổ sung carbenicillin 50 mg/l, lắc 200 vòng/phút qua đêm, sau đó tiến hành tách plasmid. Quá trình này được thực hiện theo quy trình đã được trình bày ở mục 2.2.7. Plasmid được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8%. 
Hình 3.10. Kết quả điện di plasmid tách chiết M : thang maker 1kb; T1,T2,T3,T4,T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14, M1, Qx, G1, PQ64 : các plasmid của mồi rbcL Qua kết quả điện di plasmid hình 3.10 ta thấy các plasmid tái tổ hợp đều có 3 băng rõ nét không bị đứt gẫy. Để kiểm tra chính xác sự có mặt của DNA đã được biến nạp chúng tôi tiến hành xử lý plasmid thu được bằng enzyme cắt giới hạn BamHI. 3.4.6. Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợpCác plasmid sau khi tách chiết cần tiến hành cắt kiểm tra plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI để khẳng định plasmid có mang đoạn gen quan tâm hay không. Theo lý thuyết sau khi xử lý plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn sẽ thu được 2 phân đoạn có DNA: i) đoạn DNA đã được biến nạp và ii) phần plasmid còn lại sau khi đã mất đoạn DNA.   
2500 bp 750 bp Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme BamHI mồi rbcL. M : thang Marker 1Kb; T1, T2, T3, T4, T6, T7, T8 : Các sản phẩm cắt của các plasmid được tách dòng đoạn gen rbcL Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid bằng BamHI ở các mẫu(T1,T2, T3, T4, T6, T7, T8)từ các plasmid được tách dòng đoạn gen rbcL cho thấy các mẫu plasmid đều phân thành hai băng trong đó có băng DNA kích thước 750 bp quan tâm. Với các mẫu còn lại của mồi rbcL và 3 mồi còn lại chúng tôi cũng thu được kết quả tương tự. Các đoạn gen này đã được xác định trình tự trên máy xác định trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer. Каталог: files -> ChuaChuyenDoi ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05 ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường tải về 477.37 Kb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|
