Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu

tải về 477.37 Kb.

trang	6/10
Chuyển đổi dữ liệu	30.08.2016
Kích	477.37 Kb.
	#28448

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Các bước nghiên cứu

- Thu thập mẫu lá ở các cây dó bầu

- Tách chiết tinh sạch DNA tổng số từ 18 mẫu dó bầu

- Sử dụng phương pháp PCR để nhân bản đoạn gen quan tâm với mồi đặc hiệu

- Tách dòng đoạn gen quan tâm

- Xác định trình tự gen và phân tích kết quả

2.2.2. Các phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu cây dó bầu

DNA được tách chiết bằng phương pháp CTAB có cải tiến bao gồm các bước sau.

Cân 200 mg mẫu lá cây dó bầu và nghiền cẩn thận trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn, chuyển ngay vào ống eppendorf 2 ml.
Bổ sung 1 ml đệm rửa (thành phần bảng 2.3) vào ống eppendorf 2 ml, voltex tạo thành dịch đồng nhất. Ly tâm 13000 vòng/phút (v/p) trong 5 phút.
Bổ sung 0,6 ml đệm tách chiết (thành phần bảng 2.4), đảo nhẹ thành hỗn hợp đồng nhất. Ủ trong 1 giờ 30 phút ( thỉnh thoảng đảo đều ).
Bổ sung 0,8 ml chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo đều. Ly tâm 13000 v/p ở 4^oC. Hút dịch nổi cho vào ống eppendorf 1,5 ml mới.
Bổ sung 0,8 ml isopropanol, đảo nhẹ, để ở tủ -20^oC trong 1 giờ (ít nhất 20 phút). Ly tâm 13000 v/p trong 15 phút ở 4^oC, loại bỏ dịch nổi thu tủa.
Bổ sung 0,8 ml cồn 70%. Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút ở 4^oC, loại cồn thu tủa.
Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng.
Hòa tan DNA trong 200 µl nước khử ion. Bổ sung 0,5 µl RNase (100 mg/ml) ủ ở 37^oC trong 2 giờ.
Bảo quản DNA tổng số ở -20^oC

Bảng 2.3. Thành phần dung dịch đệm rửa

STT	Hóa chất	Nồng độ chuẩn	Nồng độ cuối cùng
1	Sorbitol		350 mM
2	Tris-HCl (pH 8,0)	1 M	100 mM
3	EDTA (pH 8,0)	0,5 M	5 mM
4	Sordium metabisulfit		5%

Bảng 2.4. Thành phần dung dịch đệm tách

STT	Hóa chất	Nồng độ chuẩn	Nồng độ cuối cùng
1	NaCl	3 M	1.5 M
2	Tris-HCl (pH 8,0)	1 M	100 mM
3	EDTA (pH 8,0)	0,5 M	20 mM
4	CTAB		4%

2.2.2.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR PTC - 100 (MJ. Research., Mỹ) với tổng thể tích là 25 µl/mẫu trong đó chứa các thành phần và nồng độ của các chất tham gia phản ứng như sau:

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR

Thành phần phản ứng	Thể tích (µl)
Nước khử ion vô trùng	12,8
Buffer (10X)	2,5
MgCl₂ (25 mM)	2,5
dNTPs (10 mM)	2,5
Primer barcode_F (100 pmol/µl)	1
Primer barcode_R (100 pmol/µl)	1
Taq DNA polymerase (6 unit/µl)	0,7
DNA	2
Tổng thể tích	25

Bảng 2.6. Chu kỳ phản ứng PCR

Bước	Phản ứng	Nhiệt độ	Thời gian	Chu kỳ
1	Biến tính	94	2 phút	30
2	Biến tính	94	30 giây
3	Gắn mồi	54	50 giây
4	Kéo dài chuỗi	72	1 phút
5	Hoàn tất kéo dài chuỗi	72	10 phút
6	Kết thúc phản ứng	4	∞

2.2.2.3. Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose

Quy trình.

- Cắt vùng gel chứa đoạn DNA quan tâm trên bản điện di.

- Cân đoạn gel vừa cắt được và xác định thể tích đoạn gel này theo quy ước 1mg trọng lượng sẽ tương đương với 1 µl thể tích.

- Bổ sung dịch kết gắn DNA vào cột tinh sạch GB (Gel Binding), theo tỉ lệ: V_mẫu:V_GB = 1:1.

- Ủ hỗn hợp ở 60^oC trong 10 phút và cứ 2 phút thì đảo nhẹ 1 lần cho đến khi gel tan hoàn toàn.

- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột liên kết DNA và ly tâm 13000 vòng/phút (v/p) trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.

- Tiếp tục bổ sung đệm rửa 0,7 ml WB (Washing Buffer), ly tâm 13.000v/p. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Ly tâm thêm 1 lần nữa trong vòng 1 phút để loại đệm WB.

- Chuyển cột sang ống Eppendorf mới 1,5 ml. Bổ sung 30 µl nước khử ion khử trùng, để ở nhiệt độ phòng 1 phút và ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút để thu mẫu DNA.

2.2.2.4. Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector

Sau khi đoạn DNA được tinh sạch, tiến hành gắn chúng vào vector tái tổ hợp thông qua phản ứng lai DNA sử dụng enzyme DNA T4 - ligase. Vector sử dụng là vector pBT (Hình 2.1)

Hình 2.1. Sơ đồ vector pBT

Phản ứng ghép nối ở điều kiện 22^oC trong 1h30’.Sản phẩm sau khi ghép nối được sử dụng để biến nạp.

Bảng 2.7. Thành phần phản ứng ligase

Thành phần phản ứng	Thể tích (µl)
H₂O	3
Buffer T4 ligase	1
pBT	1
T4 DNA ligase	1
DNA	5
Tổng thể tích	10

2.2.2.5. Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn E. Coli

Biến nạp là quá trình chuyển DNA trực tiếp vào tế bào nhận, những tế bào có khả năng tiếp nhận DNA được gọi là tế bào khả biến.

Quy trình.

- Tế bào khả biến lấy từ tủ -83 ⁰C ra và cho vào đá khoảng 10 phút trước khi biến nạp.

- Bổ sung 10 µl DNA plasmid vào ống tế bào khả biến (50 - 100 µl).

- Để ổn định trong đá trong vòng 5 phút.

- Sốc nhiệt ở 42^oC trong vòng 90 giây sau đó để trong đá 15 phút.

- Bổ sung 200 µl môi trường LB lỏng, nuôi lắc với tốc độ 200 vòng/phút, 37⁰C trong vòng 1giờ.

- Cấy trải 100 µl -150 µl trên môi trường thạch LB chứa Carbenicillin.

- Nuôi cấy trong tủ ấm 37^oC qua đêm.

- Sản phẩm sau biến nạp được cấy trải trên môi trường có chứa kháng sinh carbenicilin, X-gal và IPTG kết quả sẽ xuất hiện hai loại khuẩn lạc: khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng. Tất cả các khuẩn lạc này là những khuẩn lạc đều đã được biến nạp plasmid chứa gen kháng sinh carbenicillin nên có thể phát triển được trên môi trường chọn lọc này và phát triển thành các khuẩn lạc. Những khuẩn lạc xanh xuất hiện là do vector không có nhận được gen ngoại lai. Do vector có mang operon lacZ nên khi operon này hoạt động bình thường và khi có mặt chất cảm ứng IPTG sẽ tổng hợp enzyme β-galactosidase, enzyme này sẽ chuyển hóa cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh. Còn những khuẩn lạc trắng là do nhận được plasmid mang gen ngoại lai. Gen ngoại lai sẽ chèn vào và nó sẽ phá vỡ cấu trúc gen lacZ khi có chất cảm ứng IPTG thì gen lacZ cũng không tổng hợp enzyme β-galactosidase và không xảy ra sự chuyển hóa X-gal. Tuy nhiên không phải tất cả các khuẩn lạc trắng đều mang plasmid tái tổ hợp có chứa đoạn gen barcode chèn vào có thể là chứa đoạn gen là sản phẩm phụ của phản ứng PCR, sự đột biến trên promoter lac hay sự đứt gãy base thymine đầu 3’ của vector cũng có thể làm cho khuẩn lạc mang màu trắng. Vì vậy để có thể biết chính xác các khuẩn lạc trắng mang plasmid tái tổ hợp cần tiến hành chọn bằng phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) để phục vụ cho quá trình nghiên cứu tiếp theo.

Bảng 2.8. Thành phần môi trường chọn lọc tế bào vi khuẩn mang DNA tái tổ hợp

Hóa chất	Thể tích
Xgal (0,004%)	40 μl
IPTG(100 μM)	20 μl
Carbecilin(100 mg/l)	20 μl
LB đặc	20 ml

2.2.2.6. Chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp và tách plasmid

Chọn dòng tế bào mang DNA tái tổ hợp: Sau khi biến nạp vector tái tổ hợp vào trong tế bào E.coli, chọn lọc trên môi trường LB đặc có chứa Carbecilin 100 mg/l, Xgal 0,004%, IPTG 100 μM, ủ đĩa ở 37^oC trong 16h sẽ thu được khuẩn lạc xanh - trắng.

Tuy nhiên không phải bất cứ khuẩn lac trắng nào cũng là khuẩn lạc nhận được đoạn gen chúng ta quan tâm do vậy chúng ta cần tiến hành quá trình sàng lọc bằng phản ứng PCR - clony.

Lấy lượng phù hợp sinh khối từ khuẩn lạc lựa chọn, cho sinh khối tế bào vi khuẩn này vào trong 10 µl nước khử ion. Sau đó sử dụng 3 µl hỗn hợp này để dùng cho phản ứng PCR. Phản ứng PCR được thực hiện với thanh phần như sau

Bảng 2.9. Thành phần phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc

TT	Thành phần và nồng độ	Thể tích (µl)
1	H₂O	12,8
2	Dream Taq Buffer	2,5
3	MgCl₂	2,5
4	dNTPs (2,5 mM)	2,5
5	Mồi puC-18 xuôi (10 µM)	1,0
6	Mồi puC-18 ngược (10µM)	1,0
7	Dream Taq (5 U/µl)	0,7
8	DNA	2,0
	Tổng	25

Bảng 2.10. Chu kỳ phản ứng PCR- clony

Bước	Phản ứng	Nhiệt độ	Thời gian	Chu kỳ
1	Biến tính	94	5 phút	25
2	Biến tính	94	30s
3	Gắn mồi	54	50s
4	Kéo dài chuỗi	72	1 phút 30s
5	Hoàn tất kéo dài chuỗi	72	10 phút
6	Kết thúc phản ứng	4	∞

2.2.2.7. Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E. Coli

Quy trình tách DNA plasmid được tiến hành theo phương pháp phenol/chloroform có cải tiến sử dụng hóa chất bao gồm 3 dung dịch Sol I, Sol II và Sol III .

Bảng 2.11. Thành phần hóa chất tách plasmid

Kí hiệu	Thành phần
Sol I	Glucose (50 mM), Tris-HCL (25 mM), EDTA (10 mM)
Sol II	NaOH (0,2 N), SDS (1%)
Sol III	60 ml potassium acetate 5 M, 11,5 ml acetic acid, 28,5 ml H₂O

Tiến hành:

- Lấy dịch khuẩn đã nuôi qua đêm cho vào eppendorf 2ml, ly tâm 7000 vòng/phút (v/p) trong 5 phút. Thu lấy cặn vi khuẩn ở đáy ống.

- Thêm 100 µl dung dịch Sol , hoà tan bằng voltex cho cặn tan hoàn toàn.

- Bổ sung 200 µl dung dịch Sol II đảo nhẹ.

- Thêm 150 µl dung dịch Sol III đảo nhẹ rồi đặt trong đá 5 phút.

- Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút. Thu dịch nổi.

- Bổ sung dung dịch chloroform: isoamylalcohol (24:1) theo tỷ lệ 1:1.

- Ly tâm 13000v/p trong 10 phút. Chuyển pha trên sang ống eppendorf 1,5 ml mới.

- Bổ sung dung dịch isopropanol lạnh theo tỷ lệ 1:1, ủ ít nhất 20 phút.

- Ly tâm 13000 v/p trong 20 phút, thu kết tủa.

- Rửa kết tủa 2 lần bằng 500µl ethanol 70%, ly tâm 13000 v/p trong 10 phút.

- Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng, sau đó thêm 50 µl nước khử ion, để ở nhiệt độ phòng cho tan hoàn toàn. Plasmid được bảo quản ở -20⁰C để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

2.2.2.8. Phương pháp xử lý enzyme

Phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn

- Tiến hành

- Phản ứng cắt kiểm tra vector tái tổ hợp pBT mang DNA barcode tách chiết từ các dòng tế bào vi khuẩn E. coli chủng DH5α bằng enzyme BamHI (Fermentas) thực hiện với các thành phần như sau:

Bảng 2.12. Thành phần hóa chất dùng trong phản ứng cắt enzyme

Thành phần phản ứng	Tổng thể tích (µl)
H₂O	5
Buffer fof BamHI	1
BamHI	1
Plasmid	3
Tổng thể tích	10

Hỗn hợp phản ứng được mang ủ ở 37^o C. Sau đó mang điện di kiểm tra các plasmid đạt yêu cầu sẽ được giữ lại để mang đọc trình tự.

2.2.2.9. Phương pháp xử lý trình tự

Phân đoạn DNA chỉ thị sau khi tách dòng thành công trong vector pBT được gửi đi phân tích trình tự tại công ty Macrogen (Công ty tham gia vào dự án giải trình tự bộ gen người). Về nguyên tắc, trình tự được xác định theo nguyên tắc đọc trình tự của Sanger. Sau đó sẽ so sánh trình tự DNA này với ngân hàng gen tại Trung tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ sinh học (NCBI) của Hoa Kỳ.

Каталог: files -> ChuaChuyenDoi
ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH
ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh
ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân
ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05
ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường

tải về 477.37 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10