Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết và tinh sạch DNA tổng số
tải về 477.37 Kb.
|
- Điều hướng trang này:
- 3.2. Tìm nhiệt độ gắn mồi đăc hiệu của phản ứng PCR
- Bảng 3.1 Nhiệt độ bắt mồi và kích thước gen của các cặp mồi nghiên cứu
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.1. Kết quả tách chiết và tinh sạch DNA tổng sốĐể tách chiết DNA đạt hiệu suất và độ tinh sạch nhất thì việc lựa chọn một phương pháp tách chiết phù hợp với đối tượng nghiên cứu là rất quan trọng. Hiện nay, phương pháp tách chiết DNA sử dụng CTAB là phương pháp khá phổ biến để tách chiết DNA từ các mẫu có nguồn gốc thực vật. Phương pháp sử dụng lần đầu tiên được Murray and Thompson mô tả vào năm 1980, tới nay đã được sử dụng rất phổ biến có hiệu quả với các mẫu khó tách chiết như thực vật giàu polysaccharides hay các sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật. Trong nghiên cứu này, các mẫu lá và gỗ các cây dó bầu được tách chiết theo phương pháp CTAB các bước tiến hành như mục 2.2.1 chương 2. Quá trình này gồm 3 giai đoạn: - Giai đoạn 1: các mẫu lá dó bầu được nghiền nhanh trong nitơ lỏng thành bột mịn bằng cối chày sứ để phá vỡ tế bào. - Giai đoạn 2: Làm biến tính protein, loại bỏ protein và các thành phần hữu cơ khác bằng phenol: chloroform:isoamylalcohol (25 : 24 : 1).
Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số của một số mẫu dó bầu nghiên cứu - Giai đoạn 3: Tủa DNA bằng isopropanol hay ethanol 100%, thường tủa bằng isopropanol lạnh trước, sau đó tiếp tục rửa cặn DNA bằng ethanol. Sau đó để loại bỏ RNA chúng tôi bổ sung thêm 0,5µl RNase (100mg/ml) ủ ở 37oC trong 2 giờ. Chất lượng DNA thu được sau tách chiết và tinh sạch ảnh hưởng rất lớn đến kết quả quá trình nghiên cứu. Một số vấn đề thường hay gặp là DNA thu được sau khi tách chiết bị phân huỷ và đứt gãy. Do vậy sau khi tách chiết DNA, chúng tôi kiểm tra chất lượng DNA thu được bằng phương pháp điện di. Kết quả sau khi điện di trên gel agarose 0,8% và nhuộm bằng Ethidium bromide (hình 3.1) cho thấy DNA thu được sau khi tách có chất lượng tốt, DNA không bị đứt gẫy, các băng vạch đều sáng rõ. 3.2. Tìm nhiệt độ gắn mồi đăc hiệu của phản ứng PCRKhuếch đại đoạn gen là công đoạn đầu tiên nhằm nhân lên các đoạn DNA chỉ thị mong muốn sử dụng các cặp mồi đặc hiệu. Trong nhiều công bố gần đây về sử dụng DNA barcode (Yonghua Li và cộng sự, 2010), các tác giả cho thấy việc nhân bản thành công các trình tự DNA barcode bằng phản ứng PCR phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng DNA dùng làm khuôn và đặc biệt là nhiệt độ bắt mồi đặc hiệu (Yonghua Li và cộng sự, 2010). Bảng 3.1 Nhiệt độ bắt mồi và kích thước gen của các cặp mồi nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm xác định nhiệt độ bắt mồi tối ưu nhằm nhân bản đặc hiệu các trình tự barcode của 4 cặp mồi. Bốn cặp mồi chúng tôi tiến hành nghiên cứu được thiết kế dựa theo Vijayan và Tsou (2010). Chúng tôi tiến hành thử nghiệm nhiệt độ gắn mồi của 4 cặp mồi và kiểm tra kích thước nhân bản thực tế của 4 gen này với 18 mẫu dó bầu. Sau quá trình thử nghiệm với các dải nhiệt độ gắn mồi khác nhau, đã xác định được nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu cho 4 cặp mồi nghiên cứu và kích thức nhân bản của 4 gen này so với dự đoán ban đầu có sự thay đổi thể hiện trên bảng 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy ở các ngưỡng nhiệt độ thấp không thu được sản phẩm PCR hoặc sản phẩm PCR không có chất lượng tốt. Trong khi ở nhiệt độ đặc hiệu, ở tất cả các mồi đều thu được một vạch DNA duy nhất và rõ nét. Ở ngưỡng nhiệt độ cao không thu được sản phẩm PCR (hình 3.2). Nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu của 4 cặp mồi dao động từ 54 - 570C.
Hình 3.2. Kết quả chạy PCR - gradient của chỉ thị rpoB ở các ngưỡng nhiệt độ từ 49oC tới 58oC Trên hình 3.2 cho thấy ở các ngưỡng nhiệt độ khác nhau cho các kết quả khác nhau ở nhiệt độ 49oC, 50oC, 51oC, 52oC không xuất hiện băng vạch, nhiệt độ 53oC, 54oC, 55oC , 56oC, 57oC cho một băng vạch duy nhất tuy nhiên chỉ ở 54oC mới cho được băng vạch rõ nét còn các nhiệt độ còn lại băng vạch xuất hiện mờ không rõ nét, ngoài ra nhiệt độ cao hơn 57oC không thấy xuất hiện băng vạch. Do vậy, chúng tôi xác định nhiệt độ thích hợp sử dụng trong chỉ thị này là 54oC. Và chúng tôi xác định được sản phẩm PCR sử dụng mồi rpoB có kích thước khoảng 500 bp. Sản phẩm PCR thu được được tinh sạch để đọc trình tự. Sau khi tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi và các yếu tố khác chúng tôi tiến hành nhân bản bằng phản ứng PCR kết quả thu được với từng gen như sau: Каталог: files -> ChuaChuyenDoi ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05 ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường tải về 477.37 Kb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|
