Lời ngỏ của giáo sư Nguyễn Lân Dũng Cùng bạn đọc
tải về 3.31 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- + Các phương pháp đánh dấu
- · Đánh dấu trực tiếp
- · Đánh dấu gián tiếp
- + Đánh dấu phóng xạ và ghi phóng xạ
+ Chọn mẫu dò:Việc chọn mẫu dò có ý nghĩa quan trọng cho phép lai. Nhìn chung các nhà phân loại học vi sinh vật thường không trực tiếp thiết kế mẫu dò. Về mặt này chúng tôi đưa ra một số nội dung chủ yếu về tiêu chí chọn mẫu dò theo Stahl và Amann (1991) như sau: Mẫu dò sẽ lai với ADN đích (target) và không lai với các nguồn ADN khác có mặt trong mẫu lai. Khi phân tích các mẫu vi sinh vật với nhau thì mẫu dò nên là đoạn nucleotid đặc trưng cho các mẫu phân tích để phân biệt với các sinh vật khác. Tuy việc chọn mẫu dò cũng mang tính kinh nghiệm, mẫu dò đôi khi không cần phải là toàn bộ gene mà chỉ là một đoạn gene mã hoá cho một đặc tính đặc trưng cho đối tượng nghiên cứu (có thể là yếu tố kháng nguyên bề mặt, độc tố hay một gene chức năng nào đó trên plasmid). Với cách chọn mẫu dò có kích thước nhỏ (14-40 bp), có thuận lợi là các mẫu dò được tổng hợp nhân tạo và phép lai thực hiện nhanh (dưới 30 phút) trong khi đó với các mẫu dò lớn thời gian kéo dài hơn (khoảng 16 giờ). Hạn chế lớn nhất đối với các mẫu dò nhỏ là khó khăn khi đánh dấu và dẫn đến giảm tính đặc hiệu của phép lai. Một cách thường được sử dụng là thiết kế các mẫu dò từ các chuỗi ARN thông tin 16S. Cách chọn có thể căn cứ vào đoạn ADN có mặt trong các đại diện mức độ dưới loài, trong loài hay thuộc chi nghiên cứu. + Các phương pháp đánh dấu:Các kỹ thuật đánh dấu ADN được xem là lĩnh vực phát triển mạnh nhất trong sinh học phân tử. Nói chung kỹ thuật đánh dấu được chia thành kỹ thuật đánh dấu trực tiếp và gián tiếp. Trong phương pháp trực tiếp thì phần đánh dấu để phát hiện được gắn vào acid nucleic. Đối với phương pháp gián tiếp thì có một phần chức năng được gắn vào acid nucleic và phần này lại được phát hiện gián tiếp dựa vào protein bám đặc hiệu được phát hiện bằng kỹ thuật miễn dịch. Sau đây là chi tiết các phương pháp đánh dấu. · Đánh dấu trực tiếp:- Bảng dưới đây đưa ra các loại cơ chất dùng cho phương pháp đánh dấu trực tiếp dựa vào việc nhân ADN được đánh dấu lên sẽ tăng độ nhạy so với phương pháp đánh dấu chỉ được thực hiện với các mồi đơn lẻ. Đối với các phương pháp đánh dấu trực tiếp thì các nhóm tạo tín hiệu được gắn trực tiếp bằng liên kết hoá trị với nucleic của mẫu dò. - Đánh dấu trực tiếp bao gồm 2 bước chính: tạo tín hiệu dựa vào liên kết hoá trị của nhóm tín hiệu với mẫu dò và thực hiện phép lai giữa mẫu nghiên cứu và mẫu dò. Bảng 1.4. Một số cơ chất dùng cho đánh dấu trực tiếp.
Hình 1.3. Minh hoạ phương pháp đánh dấu trực tiếp (A) và gián tiếp (B)
Đánh dấu gián tiếp được thực hiện theo 3 bước: thực hiện phép lai giữa mẫu dò và mẫu ADN đích, phản ứng giữa nhóm chức năng và protein bám đặc hiệu với nhóm chức tín hiệu thông báo (reporter) và cuối cùng là tạo ra tín hiệu từ nhóm chức tín hiệu.
Mặc dù có nhiều hệ thống đánh dấu và phát hiện tín hiệu nhưng kinh nghiệm cho thấy hệ thống biotin và digoxidenin cho độ nhạy cao hơn cả. Hai hệ thống này có thể phát hiện tới mức dưới picrogam acid nucleic. Trong trường hợp với biotin thì đôi khi có mức độ nhiễu nền cao do biotin có mặt trong các sinh phẩm, còn đối với digoxigenein thì có thể không gặp khó khăn này. + Đánh dấu phóng xạ và ghi phóng xạ:Phương pháp đánh dấu phóng xạ là phương pháp được dùng phổ biến trong các phòng thí nghiệm lai ADN với các thành phần đánh dấu là 32P và 35S. Kết quả của phép lai giữa mẫu dò và ADN đích được phát hiện trên X-phim hoặc nhấp nháy lỏng. Ưu điểm nổi bật của phương pháp đánh dấu phóng xạ là độ nhạy có thể đạt tới dưới mức picrogam ADN đích. Hạn chế của phương pháp này là không đạt được sự thích hợp cần thiết cho các thí nghiệm chẩn đoán liên quan tới xác định mẫu vi sinh vật, ví dụ thời gian bán huỷ mẫu dò ngắn, nguy hiểm cho người sử dụng và cần yêu cầu an toàn nghiêm ngặt cho phòng thí nghiệm và cá nhân sử dụng cũng như việc quản lý chất thải. Xuất phát từ thực tế trên mà càng ngày người ta càng quan tâm đến các phương pháp đánh dấu phi phóng xạ. Mục tiêu là đạt được một hệ thống đánh dấu có độ nhạy tương đương với phương pháp dùng chất phóng xạ. Bảng dưới đây liệt kê các yêu cầu lý tưởng cho phương pháp đánh dấu mẫu dò: 1, Dễ gắn với acid nucleic theo phương pháp đơn giản và có độ lặp lại cao. 2, Bền trong điều kiện lai và bảo quản. 3, Không bị ảnh hưởng và làm ảnh hưởng đến phản ứng lai. 4, Có thể thực hiện với điều kiện phản ứng lai trong dịch thể (liquid phase) hay có chất mang (solid phase). 5, Phương pháp phát hiện nhạy và đơn giản. 6, Dễ bị loại bỏ sau phản ứng lai. 7, Dễ phân biệt giữa mẫu lai và mẫu chưa lai trong cùng điều kiện. 8, Có thể ứng dụng với hệ thống tự động hoá. Tuy nhiên, nếu theo các yêu cầu lý tưởng trên thì chưa có hệ thống đánh dấu phi phóng xạ nào thoả mãn. Hiện nay, có nhiều hệ thống đánh dấu phi phóng xạ đạt độ nhạy cao và đó là lý do các phương pháp này đang được ứng dụng rộng rãi đặc biệt là phương pháp dựa trên các enzym như Alkaline phosphatase, Horseradisk peroxidase. Tuy nhiên phương pháp sử dụng các chất phóng xạ hiện tại vẫn đang được dùng cho một số phòng thí nghiệm đặc biệt. Каталог: file -> downloadfile8 downloadfile8 -> Bài Luận Đề tài: Mối lien hệ giữa dân số và môi trường MỤc lụC downloadfile8 -> Bài 1: ( 5 điểm) A=24,4872 1\ Tính a = 2\ Tính giá trị của biểu thức: B=7,708220309 B= tại X =; z = 4 Bài 2 downloadfile8 -> Đề tài: Kỹ thuật truyền số liệu trong mạng máy tính cục bộ Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện downloadfile8 -> CHƯƠng I: TỔng quan về audio- video số TỔng quan về audio số downloadfile8 -> NGƯỜi coi thi đ ĐỀ chính thứC downloadfile8 -> Đề Tài Liên hệ thực tiễn việc áp dụng các học thuyết Phương Đông ở doanh nghiệp Toyota tại Việt Nam hiện nay downloadfile8 -> Phát triển các hình thức liên doanh với nước ngoài trong sản xuất hàng xuất khẩu ở Nghệ An MỞ ĐẦU downloadfile8 -> Luận văn TÌnh hình thưƠng mại giữa việt nam và CÁc nưỚc khối nam mỹ downloadfile8 -> Đề tài Thái độ của người hâm mộ sau khi kết thúc giải bóng đá vô địch quốc gia Việt Nam năm 2012 downloadfile8 -> SỞ gd&Đt quảng ngãi kỳ thi chọn học sinh giỏi cấp trưỜng trưỜng thpt chuyên năm họC 2011-2012 tải về 3.31 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|