Lời ngỏ của giáo sư Nguyễn Lân Dũng Cùng bạn đọc
· Chiến lược đánh dấu với chất phi phóng xạ
tải về 3.31 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- 2, Phương pháp phát hiện dựa vào thay đổi màu
- 3, Cơ chất huỳnh quang và phát xạ huỳnh quang theo thời gian.
- + Quá trình lai
- Lai trong môi trường dịch thể
· Chiến lược đánh dấu với chất phi phóng xạ.Có 3 phương pháp đánh dấu phi phóng xạ: 1, Dùng cơ chất hoá phát xạ và sinh phát xạ, trong trường hợp này thì cả cơ chất hoá và sinh phát quang đều tạo ra các bức xạ ánh sáng và sau đó là phương pháp phát hiện bức xạ này. * Với nguồn cơ chất hoá phát quang có loại như AMPPD (Bronstein, Edward & Voyta, 1989) có thể được dùng trực tiếp như là cơ chất cho enzym Alkaline phosphatase trong phép lai ADN đạt độ nhạy cao trong thời gian ngắn (Bronstein et al., 1990). * Phương pháp phát xạ sử dụng enzym Alkaline phosphatase trên cơ sở giải phóng D-luciferin từ cơ chất, ví dụ D-luciferin-O-phosphate (Miska và Geiger., 1987). Hai phương pháp này tương đối nhạy và đang được sử dụng rộng rãi. 2, Phương pháp phát hiện dựa vào thay đổi màu:Phương pháp đo màu có thể thực hiện trên môi trường dịch thể hay chất mang và khá nhạy so với phương pháp phát quang. Người ta đã tạo ra các cơ chất sinh màu khi có mặt enzym (chẳng hạn như Alkaline phosphatase). Lợi thế của phương pháp này là việc phát hiện đơn giản do kết quả là sự thay đổi màu dễ phát hiện và ứng dụng trong các phòng thí nghiệm vi sinh vật. Một phương pháp có thể làm tăng độ nhạy của phản ứng màu bằng cách thêm một enzym kích hoạt phản ứng màu vào hệ thống. Một ví dụ cho điều này là vai trò loại nhóm phosphat của phân tử NADP thành NAD do Alkaline phosphatase trong hệ thống phát hiện mẫu dò nucleic. Trong hệ thống này thì NAD có vai trò kích hoạt chu trình oxy hoá mà có sự tham gia của alcohol dehydrogenease và diaphorase. Trong mỗi một chu trình thì NAD sẽ bị khử thành NADPH + H+. Phản ứng oxy hoá này lại kèm theo phản ứng oxy hoá mà NADPH + H+ lại bị oxy hoá thành NAD, mọi phản ứng xảy ra gắn liền với việc khử ρ-indonitro-tetrazolium màu tím thành formazan. Sản phẩm cuối cùng formazan được định lượng bằng phép so màu (Self. 1985). 3, Cơ chất huỳnh quang và phát xạ huỳnh quang theo thời gian.Sử dụng cơ chất phát xạ huỳnh quang là phương pháp khá nhạy và có thể phát hiện được tới một phân tử chất phát xạ (fluorescein). Nói chung với các mẫu sinh phẩm thường có mức độ nhiễu tín hiệu nền cao. Thực tế này có thể được cải thiện với cơ chất fluorophore bền bị kích hoạt bởi sóng ánh sáng. Sự phát xạ sau đó được ghi lại khi các bức xạ nền đã bị giảm. Đối với phương pháp dùng Alkaline phosphatase thì việc phát hiện nhân tố gắn lanthanide theo thời gian đi kèm với hoạt tính enzym này gọi là phương pháp phát quang lanthanide khuyếch đại bởi enzym (EALL: Evangelista, Pollack & Templeton, 1991). Trong trường hợp này, cơ chất không có khả hình thành phức hệ gắn với lathanide phát xạ. Dưới tác dụng của Alkaline phosphatase thì cơ chất và lanthalide bị chuyển thành phức hệ hoạt động. Phương pháp này khá nhạy nhưng hạn chế lớn nhất của nó là cần thiết bị kích hoạt và đo bức xạ huỳnh quang. + Quá trình lai:Nói chung quá trình lai (Hybridization ) được tiến hành theo một trong 3 cách sau để định danh hay xác định vi sinh vật: Lai với vi sinh vật (in situ), lai trong dịch thể và lai với chất mang (solid support). a. Kỹ thuật lai với vi sinh vật (in situ), hình 1.4.
Hình 1.4. Minh hoạ kỹ thuật lai in situ với kỹ thuật FISH (fluorescence in situ hybridization) phát hiện vi khuẩn Helicobacter pylori. Kỹ thuật này được thực hiện để định vị chuỗi acid nucleic trong vi sinh vật sau khi đã được cố định trong các tiêu bản hiển vi. Tuy nhiên, do hầu hết các vi sinh vật có khả năng thấm (hay cho phép) các đoạn ngắn oligonucleotid đánh dấu đi vào tế bào sau khi cố định mẫu vì vậy khi sử dụng mẫu dò đánh dấu với chất nhuộm huỳnh quang đặc biệt có thể nhìn thấy được trực tiếp vi sinh vật dưới kính hiển vi huỳnh quang. Điều đáng chú ý là phản ứng lai phải tiến hành trong thiết bị được hàn kín nhằm hạn chế việc bay hơi của dịch lai. Việc bay hơi dịch lai này dẫn đến việc bám không đặc hiệu của chất nhuộm huỳnh quang với tế bào. Nhiệt độ lai phụ thuộc vào oligonucleotid mẫu dò. Sau phản ứng lai thì mẫu phải được xem ngay hoặc được bảo quản trong tối trong thời gian 6 tháng. Nếu mẫu dò đặc hiệu cho RNA thì độ nhạy tăng lên rất lớn vì có tới hàng ngàn bản copy của RNA trong mỗi tế bào (Stahl và Amman, 1991). Lai trong môi trường dịch thể:Phản ứng lai trong môi trường dịch thể xảy ra nhanh hơn nhiều so với môi trường có chất mang pha rắn (soild). Do cả phân tử ADN đích và mẫu dò đều có thể di động tự do trong môi trường do đó phản ứng đạt kết quả cao nhất. Nói chung với phép lai thực hiện trong dịch thể thì thời gian kết thúc nhanh hơn từ 5-10 lần so với trong điều kiện là chất mang (Bryan, et al., 1986). Tuy nhiên, cũng có thể bổ sung thêm chất mang làm tăng phản ứng lai. Cần thêm bước cuối cùng là tách phức hợp mẫu dò-sợi ADN đích. Hạn chế ở đây là mẫu trong dịch cho nên có thể tạo lên các nền kém đặc hiệu, do vậy cần các giải pháp làm hạn chế mức độ nhiễu của nền cho thích hợp. 
Hình 1.5. Minh hoạ kỹ thuật lai trong môi trường dịch thể. Trên thực tế hầu hết các KIT thương phẩm dùng cho vi sinh vật đều tiến hành trong môi trường dịch thể. Vi sinh vật trong mẫu đầu tiên được phân giải trong điều kiện thích hợp để ADN đích lai với mẫu dò. Sau đó là bước lai và tách phức hệ mẫu dò và ADN đích dựa vào các thông số của phép lai theo kiểu kẹp díp cụ thể. Các phép lai theo kiểu kẹp díp (hình 1.9) cần có hai đoạn ADN có trình tự khác nhau; một đoạn để bám giữ ADN đích gắn vào chất mang và một đoạn là mẫu dò. Điều quan trọng là hai đoạn ADN này phải có trình tự khác nhau cho dù chúng đều gắn với hai vùng khác nhau trên đoạn ADN đích theo nguyên tắc bổ sung. Mẫu dò đánh dấu được bổ sung vào trong dung dịch có các đoạn ADN đích nghiên cứu. Như vậy theo hình vẽ phức hợp ADN mẫu dò đánh dấu để phát hiện gắn với ADN đích và phức hợp mẫu dò- ADN đích gắn vào chất mang đã được hình thành. Phức hợp này được tách ra khỏi dung dịch và khi có mặt cơ chất thích hợp để phát hiện được mẫu dò đánh dấu. Khi dùng hệ thống phát hiện dựa vào các hoá chất huỳnh quang hay tạo màu có thể dùng thiết bị phát hiện kết quả một cách tự động. Каталог: file -> downloadfile8 downloadfile8 -> Bài Luận Đề tài: Mối lien hệ giữa dân số và môi trường MỤc lụC downloadfile8 -> Bài 1: ( 5 điểm) A=24,4872 1\ Tính a = 2\ Tính giá trị của biểu thức: B=7,708220309 B= tại X =; z = 4 Bài 2 downloadfile8 -> Đề tài: Kỹ thuật truyền số liệu trong mạng máy tính cục bộ Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện downloadfile8 -> CHƯƠng I: TỔng quan về audio- video số TỔng quan về audio số downloadfile8 -> NGƯỜi coi thi đ ĐỀ chính thứC downloadfile8 -> Đề Tài Liên hệ thực tiễn việc áp dụng các học thuyết Phương Đông ở doanh nghiệp Toyota tại Việt Nam hiện nay downloadfile8 -> Phát triển các hình thức liên doanh với nước ngoài trong sản xuất hàng xuất khẩu ở Nghệ An MỞ ĐẦU downloadfile8 -> Luận văn TÌnh hình thưƠng mại giữa việt nam và CÁc nưỚc khối nam mỹ downloadfile8 -> Đề tài Thái độ của người hâm mộ sau khi kết thúc giải bóng đá vô địch quốc gia Việt Nam năm 2012 downloadfile8 -> SỞ gd&Đt quảng ngãi kỳ thi chọn học sinh giỏi cấp trưỜng trưỜng thpt chuyên năm họC 2011-2012 tải về 3.31 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|