+ Kỹ thuật lai dựa vào màng

         + Kỹ thuật lai dựa vào màng:

         Khi phát hiện typ vi sinh vật, chúng ta phải sử dụng kỹ thuật Southern. Trong phương pháp này ADN của nhiễm sắc thể được tinh sạch và được xử lý với enzym cắt hạn chế thích hợp, sau đó mẫu lại được điện di trên gel agarose và tạo ra dấu vân (finger print) của nhiễm sắc thể. Sau khi điện di gel được đặt dưới màng nitrocellulose hay màng nylon nằm giữa một số lớp giấy. Lớp giấy lọc phía trên được đặt trên cùng phần gel và màng kẹp giữa giấy lọc như trong hình 1.6.

Kết quả là đệm từ phía dưới được thấm một cách tự nhiên lên trên. Điều đó giúp cho việc chuyển các mảnh ADN từ gel lên màng và bám chặt vào màng với kích thước và phiên bản đúng như trên gel sau khi điện di (mô tả chi tiết theo Sambrook 1989).

Phương pháp truyền thống này cũng được cải tiến khi dùng màng nylon để chuyển ADN trong điều kiện biến tính (Read và Mann 1985). Thời gian chuyển có thể vài giờ hoặc qua đêm. Việc cố định ADN trên màng được thực hiện sau đó bằng cách xử lý nhiệt hay tia UV như đã trình bày ở trên. Tuy nhiên, nhiều phương pháp cải tiến được thực hiện nhanh như chuyển bằng điện di (Bittner, Kupfere, Morris, 1980) hay sử dụng bơm chân không (Medveczky, 1987; Olszewsk, 1988).

Trong nhiều trường hợp dùng điện để chuyển ADN từ gel agarose lên màng thì trước tiên gel phải được xử lý biến tính và được làm trung hoà trở lại. Gel được đặt giữa hai bản điện có các bản giấy thấm (hình 1.7).

         Sau đó nguồn điện được nối và lúc đó ADN sẽ được chuyển lên màng. Thời gian chuyển sẽ phụ thuộc vào kích thước đoạn ADN nhưng thường dao động trong khoảng 1-3 giờ. Phương pháp có thể thực hiện theo chiều thẳng đứng hay chiều nằm ngang. Hiện nay có một số thiết bị bán trên thị trường được dùng cho kỹ thuật này. Với thiết bị nằm thẳng đứng, thì toàn bộ được ngâm trong đệm và có thể tăng cường độ dòng điện (chú ý vì có thể làm tăng nhiệt độ), phương pháp này cần dùng nhiều đệm. Ngược lại theo phương pháp nằm ngang hay phương pháp semi-dry, ở đây gel và màng được kẹp giữa các bản giấy lọc đã tẩm ướt bằng đệm thích hợp. Trường hợp này cần rất ít đệm và cường độ dòng điện là 1mA/cm² là thích hợp.

         Trong trường hợp chuyển ADN lên màng bằng áp lực do chân không, việc thiết lập hệ thống được trình bày mà ở đó gel được đặt trên màng và sử dụng lực hút chân không để đưa ADN lên màng. Dùng lực hút chân không đạt được hiệu quả chuyển ADN lên màng cao hơn phương pháp thấm tự nhiên. Hiệu quả tối đa cho chuyển gel với trường hợp geneom sau xử lý enzym cắt hạn chế có thể đạt được sau 1 giờ.

         + Phân tích RELPs với kỹ thuật lai ADN.

         Như đã trình bày, sự phức tạp trong kỹ thuật RELP đã tạo ra những khó khăn cho việc xác định các tác nhân gây bệnh trong các nghiên cứu về dịch tễ học. Điều này còn khó khăn và phức tạp hơn trong khi so sánh các kết quả thu được trên các bản gel khác nhau hoặc tại các phòng thí nghiệm khác nhau. Nguyên nhân là do số lượng các băng ADN lớn tới mức không thể xác định kích thước của chúng hay các băng thu được không lặp lại các kết quả nghiên cứu.

         Mặc dù vậy, theo phương pháp này các phổ ADN phức tạp sau khi xử lý với enzym cắt hạn chế sẽ được làm biến tính và chuyển lên màng nitroxenluloza hay nylon. Màng sẽ được lai với mẫu dò thích hợp, kết quả phổ phép lai sẽ rõ và không quá phức tạp do nó chỉ hiển thị các mảnh ADN bắt cặp với mẫu dò. Với một số lượng không lớn các mảnh hiển thị thu được sau phép lai sẽ cho phép xác định được chính xác hơn về kích thước. Điều này làm cơ sở cho so sánh giữa các gel với nhau cũng như kết quả thu được từ các phòng thí nghiệm khác nhau.

         Khi sử dụng phương pháp này cần chú ý một số mẫu dò sau:

         1, Mẫu dò có thể là đoạn RNA ribosom từ một loài sinh vật nào đó: ví dụ rRNA của E.coli có thể được các công ty thương phẩm cung cấp (Boeringer Mannheim), đây là mẫu dò khá thuận lợi và được đánh dấu phóng xạ hay với các cơ chất huỳnh quang. Ưu điểm chính của mẫu dò này ở chỗ phần RNA là đoạn khá bảo thủ do đó mẫu dò có thể dùng lai với các sản phẩm xử lý enzym cắt hạn chế của nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Có một số loài khi lai với mẫu dò chỉ cho một kết quả giống nhau trong khi đó ở loài khác khi lai các chủng với mẫu dò thì lại thu được kết quả khác nhau. Đây là cơ sở cho phương pháp ribotyping.

         2, Mẫu dò có thể là đoạn ADN ngẫu nhiên có chức năng không xác định (Tompkins et al., 1986). Mẫu dò này thường được dùng cho các loài có chứa chính các đoạn ADN này. Sử dụng các mẫu dò này đôi khi rất có ý nghĩa trong việc phân biệt các mẫu sau khi tiến hành phương pháp ribotyping (Saunders et al., 1990).

         3. Một cách khác nữa cũng được dùng là sử dụng mẫu dò là một đoạn ADN tách dòng từ một gene đã biết. Ví dụ dùng đoạn gene mã hoá cho độc tố ngoại bào (exotoxinA) sử dụng để định typ Pseudomonas aeruginosa (Ogle et al., 1987). Mẫu dò dùng gene mã hoá cho độc tố Cholera được dùng để xác định các typ cho các chủng thuộc họ phảy khuẩn sinh độc tố (Yam, Li Lung & Ng, 1989). Việc sử dụng bất kỳ loại mẫu dò nào cũng tạo ra phổ đặc trưng của phép lai có ý nghĩa cho so sánh giữa các chủng với nhau.

         Hạn chế chính của kỹ thuật này ở chỗ kết quả thu nhận chỉ khu trú phần gene bắt cặp với mẫu dò mà không đặc trưng cho cả hệ gene.

Đối tượng	Tác giả nghiên cứu và tài liệu dẫn
Aeromonas spp	Altwegg an Luthyhottenstein (1991)
Borrelia burgorferi	Wallich et al (1992)
Candida albicans	Schmid et al (1992)
Chlamydia trachomatis	Scieux et al (1992)
Corynebacterium diphtheriae	Groman et al (1993)
Cryptococcus noeformans	Spitzer (1992)
Escherichia coli	Bohm ADN Karch (1992)
Hemophilus influenzae	Forbes et al (1992)
Histoplasma capsulatum	Leathet al (1992)
Lactobacillus helveticus	Delostreyesgavilan  et al (1992)
Mycobacterium tuberculosis	Mazurek et al (1991)
Pseudomonas aeruginosa	Tompkins(1991)
Salmonella spp	Sodati ADN Piffaretti (1991)
Staphylococcus aureus	Goh et al (1992)