HÀ NỘI 2010 Lời nói đầu qcvn 4-10 : 2010/byt do Ban soạn thảo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về Phụ gia thực phẩm và chất hỗ trợ chế biến biên soạn

Loại I: Caramel thường, caramel caustic; INS No. 150a

Loại III: Caramel amoni; INS No. 150c

Loại IV: Caramel amoni sulfit, INS No. 150d

ADI đối với nhóm I “Không xác định”;

ADI đối với nhóm III = 0-160 mg/kg thể trọng

ADI đối với loại IV 0-200 mg/kg thể trọng (0-150 mg/kg thể trọng đối với dạng rắn)

Loại I: sản xuất bằng cách đun nóng riêng carbohydrat hoặc cùng với sự có mặt của acid, kiềm; không dùng hợp chất amoni hoặc sulfit.

Loại III: sản xuất bằng cách đun nóng riêng carbohydrat hoặc cùng với sự có mặt của acid, kiềm; cùng với hợp chất amoni; không dùng hợp chất sulfit.

Loại IV: sản xuất bằng cách đun nóng riêng carbohydrat hoặc cùng với sự có mặt của acid, kiềm; cùng với cả hợp chất sulfit và hợp chất amoni.

Trong tất cả các trường hợp, nguyên liệu carbohydrat có sẵn ở dạng thương phẩm là các chất làm ngọt dinh dưỡng loại thực phẩm có chứa glucose, fructose và/hoặc polyme của chúng. Các acid và kiềm là acid sulfuric hoặc citric thực phẩm và natri, kali hoặc calci hydroxyd hoặc hỗn hợp của chúng loại thực phẩm.

Hợp chất amoni được dùng là một hoặc bất kì một chất nào sau đây: amoni hydroxyd, amoni carbonat và amoni hydro carbonat, amoni phosphat, amoni sulfat, amoni sulfit và amoni hydrosulfit.

Dùng hợp chất sulfit là một hoặc bất kì một chất nào sau đây: acid sulfurơ, kali, natri và amoni sulfit và amoni hydro sulfit.

Có thể dùng tác nhân chống nổi bọt loại thực phẩm để trợ giúp quá trình sản xuất.

Loại III: Không được quá 50% chất màu là loại liên kết bởi celulose DEAE và hơn 50% chất màu là loại liên kết bởi celulose phosphoryl.

Loại IV: Hơn 50% chất màu là loại liên kết bởi celulose DEAE và tỉ số độ hấp thụ không quá 50.

Xem mô tả trong phần PHƯƠNG PHÁP THỬ.

Loại III: 53-83%

Loại IV: 40-75%

Loại III: 0,08-0,36

Loại IV: 0,10-0,60

Loại III: 1,3 -6,8%

Loại IV: 0,5-7,5%

Loại III: Không được quá 0,3%

Loại IV: 1,4-10,0%

Loại III: -

Loại IV: Không được quá 0,5%

Loại III: Không được quá 0,4%

Loại IV: Không được quá 2,8%

Loại III: Không được quá 300 mg/kg & không được quá 200 mg/kg tính theo chất màu tương đương

Loại IV: Không được quá 1000 mg/kg & không được quá 250 mg/kg tính theo chất màu tương đương

Loại III: Không được quá 40 mg/kg & không được quá 25 mg/kg tính theo chất màu tương đương.

Loại IV: -

Thuốc thử riêng :

Celulose DEAE (diethylaminoethyl) có dung lượng 0,7 mE/g, như Cellex D của Bio-Rad hoặc Celulose DEAE có dung lượng cao hơn hoặc thấp hơn tương ứng với lượng chất cao hơn hoặc thấp hơn.

Tiến hành:

Pha dung dịch chất màu caramel có độ hấp thụ xấp xỉ 0,5 tại 560 nm bằng cách cho một lượng chất màu caramel thích hợp vào bình định mức 100 ml, cùng với acid hydrocloric 0,025 N. Pha loãng tới vạch bằng acid hydrocloric 0,025 N và ly tâm hoặc lọc, nếu dung dịch vẩn đục. Lấy 20 ml dung dịch chất màu caramel, thêm 200 mg celulose DEAE, trộn kỹ trong ít phút, ly tâm hoặc lọc, và thu lấy lớp dung dịch trong phía trên. Xác định độ hấp thụ của dung dịch chất màu caramel và lớp dung dịch phía trên trong cóng đo 1 cm ở 560 nm, bằng máy quang phổ thích hợp, ngay trước đó đã chuẩn hóa với mẫu trắng là acid hydrocloric 0,025 N. Tính phần trăm chất màu liên kết bởi celulose DEAE theo công thức:

Trong đó:

A₁ là độ hấp thụ của dung dịch chất màu caramel ở 560 nm

A₂ là độ hấp thụ của lớp dung dịch phía trên sau khi xử lí với Celulose DEAE ở 560 nm.

Thuốc thử riêng:

Celulose phosphoryl dung lượng 0,85 mE/g, như Cellex P ở Bio-Rad hoặc Celulose phosphoryl dung lượng cao hơn hoặc thấp hơn tương ứng với lượng chất cao hơn hoặc thấp hơn.

Tiến hành:

Cho khoảng 200-300 mg chất màu caramel vào bình định mức 100 ml, pha loãng tới vạch bằng acid hydrocloric 0,025 N và ly tâm hoặc lọc, nếu dung dịch vẩn đục. Lấy 40 ml dung dịch chất màu caramel, thêm 2,0 g celulose phosphoryl, lắc kỹ trong ít phút. Ly tâm hoặc lọc, và thu lấy lớp dung dịch trong phía trên. Xác định độ hấp thụ của dung dịch chất màu caramel và lớp dung dịch phía trên trong cóng đo 1 cm ở 560 nm, bằng máy quang phổ thích hợp, ngay trước đó đã chuẩn hóa với mẫu trắng là acid hydrocloric 0,025 N. Tính phần trăm chất màu liên kết bởi celulose phosphoryl theo công thức:

Trong đó:

A₁ là độ hấp thụ của dung dịch chất màu caramel ở 560 nm

A₂ là độ hấp thụ của lớp dung dịch phía trên sau khi xử lí với Celulose phosphoryl ở 560 nm.

Tiến hành:

Cho khoảng 100 mg chất màu caramel vào bình định mức 100 ml cùng với nước, pha loãng tới vạch bằng nước, lắc đều và ly tâm, nếu dung dịch vẩn đục. Lấy 5,0 ml dung dịch trong này cho vào bình định mức 100 ml, pha loãng tới vạch bằng nước, và lắc đều. Xác định độ hấp thụ của dung dịch 0,1% trong cóng đo 1 cm ở 560 nm và của dung dịch pha loãng 1:20 ở 280 nm, bằng máy quang phổ thích hợp, ngay trước đó đã chuẩn hóa với mẫu trắng là nước. (Máy quang phổ thích hợp là máy có bộ đơn sắc hóa cho độ rộng dải 2 nm hoặc nhỏ hơn và tỷ lệ ánh sáng lạc là 0,5% hoặc nhỏ hơn.) Tính tỉ số độ hấp thụ của chất màu caramel bằng cách chia giá trị độ hấp thụ của chất màu caramel ở 280 nm nhân 20 (hệ số pha loãng) cho giá trị độ hấp thụ ở 560 nm.

% chất rắn =

Trong đó:

m₃ = khối lượng cuối cùng của caramel thêm cát (g)

m2 = khối lượng cát (g)

m₁ = khối lượng caramel thêm vào ban đầu (g)

Tính toán trên cơ sở chất rắn

Hàm lượng nitơ toàn phần, lưu huỳnh toàn phần, nitơ amoni, lưu huỳnh dioxyd, 4-MEI và THI được biểu thị theo chất rắn. Xác định nồng độ (C_i) của mỗi tạp chất theo nguyên trạng; nồng độ (C_S) theo chất rắn được tính theo công thức:

C_i  100

% chất rắn

C_{s =}

Tiến hành:

Cho khoảng 100 mg chất màu caramel vào bình định mức 100 ml cùng nước, pha loãng tới vạch bằng nước, lắc đều và ly tâm, nếu dung dịch vẩn đục. Xác định độ hấp thụ (A₆₁₀) của dung dịch trong này trong cóng đo 1 cm ở 610 nm bằng máy quang phổ thích hợp, ngay trước đó đã chuẩn hóa với mẫu trắng là nước. Tính cường độ màu của chất màu caramel theo công thức sau:

A₆₁₀  100

% chất rắn

Cường độ màu =

Xác định % chất rắn như mô tả ở phần Hàm lượng chất rắn.

Tính toán trên cơ sở chất màu tương đương: Khi có thêm các giới hạn đối với 4-MEI và THI được biểu thị theo chất màu tương đương thì các nồng độ trước hết được tính trên cơ sở chất rắn như chỉ dẫn trong phần "Tính trên cơ sở vào chất rắn", và sau đó biểu thị theo chất màu tương đương theo công thức:

C_S  0,1

cường độ màu

Màu tương đương =

Trong đó:

C_S = nồng độ trên chất rắn.

Như vậy hàm lượng được biểu thị bằng một sản phẩm có cường độ màu là 0,1 đơn vị độ hấp thụ.

Sử dụng thiết bị Monier-Williams cải tiến (có ở 5GA Scientific, Inc., Bloomfield, N.J., Mỹ) để xác định acid sulfurơ, hoặc dụng cụ thiết kế như trình bày ở hình. Bộ dụng cụ gồm một bình cất đáy tròn ba cổ 1000 ml có ống nối thủy tinh vuốt thon chuẩn 24/40. Gắn kèm một sinh hàn Allihn 30 cm hồi lưu ở một cổ phía ngoài của bình, và đầu kia của sinh hàn nối với một ống Tygon hoặc silicon ¼ inch (được đun sôi trước với dung dịch acid hydrocloric 1/20 và rửa bằng nước) tới bộ ống hấp thụ (có nối hình cầu 35/20 hoặc tương đương). Nối cổ giữa của bình với bình gạn hình trụ 125 ml, và gắn một đoạn ống tới ống chữ U ngắn cắm qua một nắp cao su trên cổ của bình gạn. Gắn một ống vào bằng thủy tinh, cong dài, tới gần đáy bình, vào cổ ngoài khác của bình, và nối ống vào một bình rửa-khí 250 ml một đoạn ống. Bình rửa khí lại nối bằng một ống tới chai (bom khí) nitơ.

Nghiền 4,5 g pyrogalol (acid pyrogalic) với 5 ml nước trong một cối nhỏ, và cho khối nhão sang bình rửa khí. Tiếp tục nghiền phần còn lại, và chuyển toàn bộ sang bình với 2 lần 5 ml nước. Cho khí nitơ đi từ chai khí tới bình để đuổi hết không khí, và sau đó thêm vào bình qua phễu cuống dài dung dịch được làm nguội của 65 g kali hydroxyd trong khoảng 85 ml nước. Lắp đầu bình vào, và sục bong bóng nitơ qua đó để đuổi hết không khí khỏi không gian phía trên. Kẹp chặt ống ở cả hai vị trí của chai, và nối nó tới ống đầu vào của bình cất. Bình rửa khí phải được chuẩn bị như mô tả, với dung dịch pyrogalol mới pha trong ngày làm.

Thêm lần lượt vào mỗi ống hấp thụ hình chữ U như sau: hai đũa thủy tinh 8 mm chiều dài khoảng 25 mm, 10 ml hạt thủy tinh 3 mm ở đầu ra, 10,0 ml dung dịch hydrogen peroxyd 3%, và 1 giọt đỏ methyl (TS).

Lắp tất cả các phần của thiết bị, và kiểm tra xem có kín không bằng cách thổi nhẹ vào trong ống gắn với cổ bình gạn. Khi thổi, đóng khóa bình gạn. Để yên vài phút; nếu mức chất lỏng trong ống chữ U vẫn ngang bằng, đóng tất cả các khớp nối và thử lại. Nếu hệ thống khít thì tiến hành theo chỉ dẫn dưới đây.

Tiến hành:

Phân tán khoảng 25 g mẫu thử, cân chính xác, trong 300 ml nước vừa đun sôi để nguội, và chuyển khối nhão sang bình qua một phễu lỗ rộng dùng nước. Pha loãng tới khoảng 400 ml bằng nước, và khóa bình gạn lại. Thêm 90 ml acid hydrocloric 4 N vào bình gạn, và cho acid vào bình bằng cách thổi nhẹ vào ống ở cổ bình gạn. Khóa bình gạn. Mở kẹp ống ở cả hai vị trí của bình rửa khí, và bắt đầu thổi khí nitơ với tốc độ đều đặn bọt khí. Đun nóng bình cất bằng bếp áo để đun hồi lưu trong khoảng 20 phút. Khi đạt được sự hồi lưu ổn định, cấp điện đun tiếp hồi lưu trong 1,75 giờ. Tắt nước trong sinh hàn, và tiếp tục đun tới khi khớp nối phía đầu vào của ống chữ U thứ nhất xuất hiện hơi ngưng đọng và hơi ấm. Bỏ bình gạn và tắt bếp.

Khi khớp nối đầu trên của sinh hàn nguội, tháo khớp nối và tráng vào ống chữ U thứ hai, để lại ống nối với khớp ra của ống chữ U thứ nhất nhưng ngắt khỏi đầu vào của ống chữ U thứ hai. Quay ống nối tới khi đầu hở của nó gần chạm đầu vào của ống chữ U thứ nhất. Thêm 1 giọt đỏ methyl vào ống chữ U thứ nhất, và chuẩn độ bằng natri hydroxyd 0,1 N tới khi có màu vàng sáng, lắc nhẹ. Sau khi chuẩn độ ống chữ U thứ nhất, tháo ống nối, lắp nó với ống chữ U thứ hai ở đầu ra, và chuẩn độ tương tự. Ghi tổng lượng dung dịch hai lần chuẩn độ là V_t (ml).

Tiến hành làm một mẫu trắng, thể tích dung dịch natri hydroxyd 0,1 N là V_o. Tính phần trăm lưu huỳnh dioxyd trong mẫu thử theo công thức:

Trong đó

Nitơ amoniac

Trong đó

m là khối lượng của mẫu thử (g)

Dùng các nguyên vật liệu và thuốc thử sau (thuốc thử phải là loại ACS hoặc tương đương).

Nguyên vật liệu:

Bông thủy tinh loại Pyrex, cột sắc ký 22  300 mm và khoá PTFE (như Kimax 17800); cốc polypropylen 150 ml (như Nalge 1201); bình đáy tròn 250 ml (như Pyrex 4320); phễu rót bột 75 mm; thìa gạt (spatula) 5 cm; máy cất quay chân không, bếp đĩa kín, nồi cách thủy, pipet Pasteur dùng một lần; bình định mức 5 ml.

Thuốc thử:

Aceton; Celit 545; methylen clorid; natri hydroxyd; và tetrahydrofuran.

Tiến hành:

Sau khi trộn kỹ mẫu thử chất màu caramel bằng cách lắc hoặc khuấy, cân 10,00 g hỗn hợp vào cốc polypropylen 150 ml. Polypropylen được coi là tốt hơn thủy tinh vì bề mặt kị nước dễ chuyển toàn lượng mẫu thử. Thêm vào đó 5,0 g dung dịch NaOH 3,0 N và lắc kỹ để đảm bảo pH của mẫu thử lớn hơn 12. Thêm 20 g Celit 545 vào cốc trên, và trộn đều tới khi hỗn hợp gần khô lại. Quá trình này khoảng 2 tới 3 phút. Với mẫu thử có hàm lượng nước quá cao, hỗn hợp chất màu caramel-Celit 545 có thể quá ướt. Trong trường hợp này, trộn 5,00 g hỗn hợp chất màu caramel với 2,5 g NaOH 3,0 N và 15 g Celit 545 và tiến hành phân tích.

Một nút bông thủy tinh Pyrex được đặt ở phía dưới cột sắc kí 22  300 mm với khóa PTFE. Hỗn hợp chất màu caramel-Celit 545 được cho vào cột qua phễu 75 mm. Hỗn hợp trong cột được nhồi bằng cách gõ nhẹ cột theo phương thẳng đứng khoảng 10 cm trên một bề mặt có lót. Khi nhồi tốt, hỗn hợp chất màu caramel-Celit 545 phải chiếm xấp xỉ 250 mm phía dưới cột. Cẩn thận khi tiến hành để tránh nhồi lỏng quá hoặc chặt quá. Cột nhồi lỏng quá methylen clorid sẽ rửa giải quá nhanh và không chiết hoàn toàn. Cột nhồi quá chặt dẫn tới dung môi rửa giải khó tiếp cận một số vùng chất nhồi. Điều này cũng dẫn đến việc chiết không hoàn toàn.

Mở khóa, dùng cốc rót methylen clorid vào cột. Khi dung môi tới nút bông thủy tinh, đóng khoá và để dung môi tương tác với hỗn hợp trong cột 5 phút. Sau đó mở khóa và để cột được rửa giải tiếp với methylen clorid tới khi thu được 200 ml vào bình đáy tròn 250 ml. Lấy 1,00 ml dung dịch chuẩn nội 2 MEI (50,0 mg 2 MEI/50,0 ml methylen clorid) thêm vào dịch rửa giải đã thu được. 2 MEI được tách tốt khỏi 4 MEI trong điều kiện sắc kí khí lỏng đã dùng và không thấy có trong chất màu caramel.

Sau đó, loại dung môi khỏi dịch rửa giải bằng cất quay áp suất giảm ở 45-50 kPa và bình cầu đáy tròn được duy trì ở 35 ^oC trong nồi cách thủy. Cắn của dịch chiết được chuyển hoàn toàn sang bình định mức 5 ml bằng pipet Pasteur dùng một lần, bằng cách rửa bình cầu nhiều lần mỗi lần với một lượng nhỏ (khoảng 0,75 ml) tetrahydrofuran hoặc aceton. Cả hai dung môi được dùng với kết quả như nhau. Sau khi trộn kĩ hỗn hợp bằng cách lắc ngược bình nhiều lần, được dịch chiết dùng cho phân tích GLC. Dịch chiết sau khi chuẩn bị phải phân tích càng sớm càng tốt, bởi mẫu chỉ ổn định trong vòng 1 ngày sau khi chuẩn bị.

Phân tích GLC được tiến hành bằng thiết bị sắc ký khí với detector ngọn lửa hydro. Cột thủy tinh 1 m  6 mm đường kính ngoài ( 4 mm đường kính trong), thêm 7,5% Carbowax 20M + 2% KOH trên 90/100 mesh Anakrom ABS. Các thông số GLC như sau: khí mang nitơ 50 ml/phút; hydro 50 ml/phút; oxy 80 ml/phút; bộ phận tiêm mẫu 200 ^oC; cột đẳng nhiệt 180 ^oC; detector 250 ^oC; thể tích mẫu 5 µL. Tất cả quá trình định lượng tiến hành dùng kĩ thuật chuẩn nội.

THI được chuyển thành dẫn xuất 2,4-dinitrophenylhydrazon (THI-DNPH) của nó. Dẫn chất này được tách khỏi thuốc thử dư và tạp carbonyl bằng HPLC dùng cột RP-8, xác định bằng đo độ hấp thụ ở bước sóng 385 nm.

Tiến hành:

Cân chính xác chất màu caramel (200-250 mg), sau đó hòa tan trong nước (3 ml). Chuyển toàn lượng dung dịch sang phần phía trên của cột tổ hợp. Bắt đầu rửa giải bằng nước, và toàn bộ lượng nước qua các cột khoảng 100 ml.

Sau đó tháo cột phía trên. Rửa giải cột phía dưới bằng HCl 0,5 N. Bỏ 10,0 ml dịch rửa giải ban đầu, sau đó thu lấy 35 ml.

Cô dung dịch này tới khô ở 40 ^oC và 15 torr. Hòa tan cặn đặc sệt trong methanol không có carbonyl (250 µL) và thuốc thử 2,4-dinitrophenylhydrazin (250 µL). Chuyển hỗn hợp phản ứng sang lọ có nắp là tấm đệm và bảo quản 5 giờ ở nhiệt độ phòng. Tiêm 5 µL (cũng có thể từ 1 tới 25 µL) vào cột HPLC LiChrosorb RP-8 (10 µm). Pha động gồm MeOH/ H₃PO₄ 0,1 M 50/50 (tt/tt). Điều chỉnh thành phần pha động nếu đặc tính của cột thay đổi, tuỳ thuộc nhà sản xuất. (Rất nên sử dụng chất nhồi LiChrosorb RP-8, 10 µm, cột 250 ( 4 mm "Vertex" của nhà sản xuất Knauer, Bad Homburg, F.R.G.). Với tốc độ pha động 2 ml/phút và kích cỡ cột 250 ( 4,6 mm, THI-DNPH rửa giải sau khoảng 6,3±0,1 phút. Phát hiện ở 385 nm và đo chiều cao của pic. Hàm lượng được tính dựa vào đường chuẩn của THI-DNPH trong methanol.

Nguyên vật liệu:

Thuốc thử - 2,4,-Dinitrophenylhydrazin hydroclorid: 2,4-dinitrophenylhydrazin thương mại (5 g) cho vào acid hydrocloric đặc (10 ml) trong bình nón 100 ml, và lắc nhẹ tới khi base tự do (màu đỏ) chuyển thành hydroclorid (màu vàng). Thêm vào đó ethanol (100 ml), lắc và đun nóng trên cách thủy sôi tới khi tất cả chất rắn hòa tan. Sau khi kết tinh ở nhiệt độ phòng, hydroclorid được lọc, rửa bằng ether, sấy ở nhiệt độ phòng và bảo quản trong bình hút ẩm. Trong khi bảo quản, hydroclorid dần chuyển thành base tự do. Sau đó, có thể loại bằng cách rửa với dimethoxyethan. Thuốc thử được chuẩn bị bằng cách trộn 0,5 g 2,4-dinitrophenylhydrazin hydroclorid trong 15 ml methanol 5% trong dimethoxyethan trong 30 phút. Bảo quản trong tủ lạnh và kiểm tra định kỳ bằng HPLC.

- Nhựa trao đổi cation (mạnh): Dowex 50 AG x 8, H+, 100-200 mesh.

- Nhựa trao đổi cation (yếu): Amberlite CG AG 50 I, H+, (100-200 mesh). (Để lắng hai hoặc ba lần trước khi sử dụng).

- Methanol, không có carbonyl tự do: Methanol được chuẩn bị theo Y. Peleg và C.H. Mannheim, J. Agr. Fd. Chem, 18 (1970) 176, bằng cách xử lý với thuốc thử Girard P.

- Dimethoxyethan: Nếu không tinh khiết, dimethoxyethan được tinh chế bằng cách cất từ 2,4-dinitrophenylhydrazin với sự có mặt của acid và cất lại từ natri hydroxyd. Ngay trước khi sử dụng cho qua cột nhôm trung tính để loại peroxyd.

Thiết bị:

Cột tổ hợp: tương tự như đã mô tả trong J. Agr. Fd. Chem. 22 (1974) 110. Cột phía trên (150 ( 12,5 mm, chiều cao nhồi tối đa 9 cm, hoặc 200 ( 10 mm, chiều cao nhồi tối đa 14 cm, với mao quản đầu ra có 1 mm đường kính trong) nhồi chất trao đổi cation acid yếu, chiều cao chất nhồi lần lượt khoảng 50-60, hoặc 80-90 mm. Cột phía dưới (chiều dài tổng 175 mm, đường kính trong 10 mm, với đầu ra mao quản và khoá Teflon) nhồi với chất trao đổi cation acid mạnh chiều cao chất nhồi 60 mm. Bình đựng dung môi, dùng phễu nhỏ giọt (100 ml) khóa Teflon. Tất cả các phần được nối bằng khớp nối thủy tinh mài chuẩn (14,5 mm).

HPLC: với cột qui định ở trên và detector UV có khả năng đo ở 385 nm.

Chuẩn hóa: Hòa tan THI-DNPH trong methanol tuyệt đối không có carbonyl (khoảng 100 mg/L; nồng độ của THI: 47,58 ng/µL). Dung dịch này pha loãng 10 lần với methanol (4,7 ng THI/µL). Dung dịch chuẩn THI-DNPH ổn định ít nhất 20 tuần nếu bảo quản trong tủ lạnh.

- Phương pháp II.

- Sử dụng kỹ thuật hấp thụ nguyên tử thích hợp cho hàm lượng quy định để xác định. Lựa chọn cỡ mẫu thử và phương pháp chuẩn bị mẫu dựa trên nguyên tắc của phương pháp mô tả trong JECFA monograph 1-Vol. 4 phần các phương pháp phân tích công cụ.