Chương 1- tổng quan giới thiệu chung về nước mắm

Chiết rút: Quá trình kéo rút nước mắm là quá trình lọc liên hoàn. Quá trình kéo rút là quá trình rút đạm trong bã không quá nấu bằng cách dùng lượng nước bổi hoặc nước thuộc ít đạm cho chuyển lần lượt từ thùng này qua thùng khác để tăng đạm và tăng hương vị.

Phối trộn: Muốn thu được nước mắm có hương vị thơm ngon và có hàm lượng nitơ như mong muốn, ta phải pha đấu các loại nước mắm có có hàm lượng nitơ khác nhau, thường pha nước mắm có có hàm lượng nitơ cao với nước mắm có có hàm lượng nitơ thấp thành loại nước mắm có có hàm lượng nitơ trung bình.

Sản phẩm nước mắm thu được theo phương pháp cổ truyền có hương vị đặc trưng nên được người tiêu dùng ưa thích. Phương pháp này, trang thiết bị đơn giản, chi phí sản xuất thấp. Nhưng do thời gian chế biến quá dài nên hiệu quả kinh tế không cao, lượng đạm mất đi lớn, vệ sinh an toàn thực phẩm thấp.

Dựa trên cơ sở muốn rút ngắn thời gian chế biến nước mắm ta cần bổ sung enzyme proteaza và tạo điều kiện thích hợp cho enzyme hoạt động để thúc đẩy nhanh quá trình thủy phân. Để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng về nước mắm đã có nhiều nha khoa học đã nghiên cứu sử dụng enzyme proteaza nhân tạo để rút ngắn quá trình thủy phân thịt cá. Nguyễn Thị Dự (Viện công nghệ Thực phẩm) năm 1995 đã thực hiện đề tài cấp Bộ công nghiệp “Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày bằng enzyme proteaza từ B. subtilis”. Kết quả là rút ngắn quy trình sản xuất nước mắm từ 6 – 8 tháng xuông còn 2 tháng, độ đạm nước mắm tăng từ 8,3% lên 20,8% hiệu xuất thu hồi đạm tăng gấp 2 lần, tiêu hao nguyên liệu giảm 13%. Tuy nhiên các nguồn để thu enzyme có nguồn gốc từ thực vật, động vật, từ vi sinh vật, mặc dù mới nghiên cứu những năm gần đây, nhưng những nghiên cứu về enzyme từ vi sinh vật đã đem lại những thành tựu đáng kể, đóng góp to lớn vào thành công chung của việc nghiên cứu rút ngắn thời gian chế biến nước mắm. Enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật được sử dụng ưu việt hơn các nguồn enzyme khác. Ba loại enzyme vi sinh vật chính thường được sử dụng trong thuỷ phân cá là:

+ Enzyme Flavourzyme: Được sản xuất từ chủng A. oryzae, chế phẩm này bao gồm cả hoạt tính endopeptidaza và exopeptidaza. pH thích hợp cho quá trình thủy phân là 5,0 – 7,0, nhiệt độ thích hợp 45 – 55^oC [25].

+ Enzyme Alcalase: Được sản xuất từ chủng B. licheniformis, Subtilisin A là thành phần enzyme chính, đó là một endopeptindaza. Nhiệt độ thích hợp cho enzyme hoạt động tà 55 – 70^oC. pH thích hợp 6,5 – 8,5 [23].

+ Enzyme Protamex: là một enzyme proteaza của Bacillus thủy phân protein. Khác với các endopeptindaza là protamex tạo ra dịch thủy phân protein không có vị đắng ngay cả khi mức độ thủy phân rất thấp. Protamex hoạt động tối ưu ở pH 5,5 – 7,5, nhiêt độ 40 – 60^oC và bất hoạt ở nhiệt độ 90^oC trong 5 phút [24].


1.3.1. Sơ đồ quy trình sản xuất [11].

Nguyên liệu

Xử lý

Thủy phân ( Enzyme )

Dịch thủy phân

Sản phẩm

Hình 1. Sơ đồ qui trình chế biến nước mắm bằng phương pháp enzyme

Cá cần phải rửa sạch các tạp chất như bùn, rác thải, tạp chất còn lẫn trong cá. Nguyên liệu được nhập về cần tiến hành phân loại phân hạng dựa trên kích thước và chất lượng của cá, yêu cầu đặt ra với nguyên liệu làm nước mắm là đồng đều về chất lượng và kích cỡ để quá trình thủy phân diễn ra hàng loạt, đều nhau như vậy quá trình thủy phân sẽ triệt để tránh hao phí hàm lượng nitơ do còn lại trong bã gây tổn thất hàm lượng nitơ, làm giảm hiệu quả kinh tế và giảm chất lượng nước mắm. Đối với những nguyên liệu cá có khối lượng và kích thước lớn thì phải xử lý đập dập, nghiền nhỏ hoặc cắt khúc để quá trình thủy phân diễn ra hoàn thiện hơn.

Muối phải sử dụng muối ăn đã qua bảo quản, ít nhất là muối đã được bảo quản hơn một tháng và tỷ lệ muối ban đầu so với cá là 10% sau 3 ngày thì bổ sung muối một lần, mỗi lần 3% cho đến khi tổng khối lượng muối đủ 25%, thời gian thủy phân tùy theo phương pháp thủy phân.

b, Tiến hành thủy phân

Nguyên liệu cá sau khi được xử lý đập dập trộn đều với 0,1% chế phẩm enzyme proteaza đảo trộn đều trong 30 phút, để enzyme khuếch tán trong nguyên liệu, sau đó trộn với muối tỉ lệ 10% so với nguyên liệu cá và cho vào thùng có nắp đậy. Hằng ngày mở nắp đánh khuấy 2 lần mỗi lần khoảng 10 – 15 phút. Sau khi đánh đảo xong thì đậy nắp lại tránh ánh nắng chiếu trực tiếp vào khối chượp, sau 2 – 3 ngày thì cá nát nhừ và xảy ra hiện tượng cá đòi muối (khối chượp sủi bọt, mùi tanh bốc lên) lúc này ta cho thêm 3% muối nữa, sau 1 – 2 tháng chượp đã vào giai đoạn đã ổn định, mùi không còn tanh, có mùi nước mắm nhẹ. Chượp chín khi thấy nước cốt có màu vàng nâu đến màu cánh gián.

Sản xuất nước mắm theo phương pháp ngắn ngày đã đáp ứng được nhu cầu ngày cảng tăng của người dân, giảm tổn thất lượng nito trong quá trình chế biến. Tuy nhiên nước mắm sản xuất theo phương pháp ngắn ngày có nhược điểm là mùi thơm kém đặc trưng do đó chưa hấp dẫn người tiêu dùng.

1.4. Các nghiên cứu về hương nước mắm

Người Việt Nam đầu tiên tham gia nghiên cứu nước mắm là Đinh Minh Kha và Nguyễn Xuân Thọ. Các nghiên cứu xoay quanh về chế độ hoạt động của proteaza và thành phần của nước mắm. Các nghiên cứu này tập trung rất nhiều vào khu hệ vi sinh vật cá và tác dụng của chúng trong quá trình tạo ra nước mắm

Bulan Phithakpl [14] cho biết nước mắm thượng hạng của Thái Lan được sản xuất từ cá cơm. Người tiêu dùng tin tưởng rằng nước mắm từ cá cơm có hương tốt hơn nhiều so với nước mắm từ nguyên liệu khác. Hầu như tất cả các loại cá biển nhỏ đều có thể tận dụng làm nước mắm ở Việt Nam, thậm chí cả cá nước ngọt cũng được các nhà nghiên cứu đưa vào thử nghiệm. Thực tiễn cá nước ngọt không phải là nguồn nguyên liệu dồi dào nên chủ yếu Việt Nam vẫn sản xuất từ các loại cá biển nhỏ: Cá nục, cá thu, cá tráp…Những cơ sở sản xuất có nguồn nguyên liệu truyền thống là cá cơm ở Việt Nam đã nổi tiếng với các loại nước mắm với thương hiệu riêng: Nước mắm Phú Quốc, nước mắm Nha Trang, Phan Thiết….cơ sở sản xuất nước mắm ở miền Bắc đa số sản xuất từ các loại cá biển nhỏ (cá tạp). Thông thường ở các xí nghiệp này (ví dụ như: Xí nghiệp nước mắm của Hội Nghệ An, Xí nghiệp nước mắm Hải Thịnh - Nam Định) luôn phải tạo ra các chượp hương. Các chượp này khác với các lô chượp còn lại ở chỗ nguyên liệu đưa vào là các cơm hoặc cá trích. Nước mắm rút ra từ các ô bể khác trước khi đem chế biến, pha đấu tạo thành nước mắm thành phẩm cho chay qua chượp hương để tăng hương vị đặc trưng. Điều này có nghĩa là trong dân gian, tuy chưa giải thích được việc tạo hương, nhưng kinh nghiệm của các nhà sản xuất đã cho thấy mối quan hệ giữa nguyên liệu là hương nước mắm.

• 
  Cá cơm là loại cá ăn nổi, hoạt động mạnh nên thành phần của cá ít mỡ. Trong sản xuất không thấy nổi lên lớp váng mỡ dấy trên bề mặt bể chượp như các ô bể khác. Vì vậy mùi vị ôi khét của nước mắm ít xảy ra (do oxy hóa lớp dầu mỡ bởi oxy trong khí quyển).
  
• 
  Cá cơm nói riêng và các loại cá nổi hoạt động nhiều nói chung có hoạt tính enzyme proteaza trong thịt cá, ruột cá cao hơn các cá khác nên quá trình thủy phân xảy ra nhanh hơn. Vì vậy cùng một đơn vị thời gian sản xuất 6- 12 tháng thì các ô bể có nguyên liệu là cá cơm thủy phân triệt đẻ hơn không còn mùi tanh, ngái của cá.
  
• 
  Cá cơm kích thước nhỏ hơn các loại cá khác nên dễ thủy phân, có thể các chất tạo hương được hình thành từ sự phân giải thịt cá qua sự tác dụng của vi sinh vật và enzyme trong cá
  

Nước mắm không chỉ được sản xuất ở Việt Nam mà còn sản xuất ở nhiều nước khác nhau như: Thái Lan, Campuchia, Malaixia, Philippin, Hồng Kông, Trung Quốc. Đã có rất nhiều công trình khoa học của các tác giả nước ngoài công bố về mối liên quan của một số thành phần hóa học trong nước mắm đến vị của nước mắm ở Thái Lan, Philippin, Hồng Kông. Kết quả nghiên cứu của Doagan và Haward [18] năm 1975 đã được nhiều nhà khoa học khác như: Mitsuya Shimoda, Rossana.R.Peralta, Yutaka Osajima [22], Clifford.G.Beddows Arhes G [16] công nhận và coi như là cơ sở lý thuyết để ban đầu để lý giải chi tiết về nguyên do phát sinh ra chúng. Tóm tắt kết quả nghiên cứu của Dougan và Haward về hương nước mắm có thể tóm tắt là: Hương nước mắm được hình thành từ ba loại hương vị khác nhau.

• 
  Mùi amoniac: chủ yếu do sựu tồn tại của amoniac và trimethylamin
  
• 
  Mùi phó mát được hình thành từ các acid béo bay hơi phân tử lượng thấp. Các aicd béo dễ bay hơi này tồn tại theo một tỉ lệ đặc trưng cùng với sự tham gia ưu thế của ethernoic và acid butanoic
  
• 
  Mùi thịt cá: nó không do một chất riêng nào mà phụ thuộc vào số lớn các chất dễ bay hơi.
  

Ở trong nước việc phân lập và nhận dạng vi sinh vật có trong nước mắm đã được tác giả Nguyễn Thị Hoa [35] bước đầu nghiên cứu nhưng ở mức độ nhỏ chưa có tính bao quát. Nghiên cứu của Dương Văn Hợp [2], của Nguyễn Trọng Cẩn [3] về vi sinh vật có liên quan đến sinh hương như Bacillus Subltilis, Clostridium. Gần đây nghiên cứu của giáo sư Phạm Thành Hổ đã phân lập được một số vi sinh vật có khả năng sinh hương như Staphylococcus intermedius, Vibrio costicola [7]

Năm 1930 Boez và Guillerm [32,33] đã phân lập được một chủng từ cá và từ giai đoạn đầu của quá trình sản xuât nước mắm. Đó là vi khuẩn yếm khí, tạo bào tử. Ông cho rằng đó là một chủng mới thuộc nhóm Clostridium có liên quan đến tạo hương vị đặc biệt cho nước mắm. Vi khuẩn này có đặc tính kị khí bắt buộc, phát triển tốt trong môi trường có đường glucoza, maltoza, fructoza và đường kính, tạo khí, nhiệt độ thích hợp từ 28 – 45⁰C. Nó có thể tạo enzyme proteaza trong môi trường muối, chủ yếu chúng tạo ra các hợp chất chưa nitơ, dễ bay hơi trong nước mắm. Sau này tác giả Trương Văn Chôm [15] đã phát hiện ra acid axetic và acid n.butanoic và giả thiết rằng có thể vi khuẩn lên men lactic liên quan đến vấn đề tạo hương. Việc phân hủy protein từ cá là do hai nguyên nhân chính: Do enzyme có sẵn trong cá và do enzyme từ vi sinh vật trong nước mắm

Các sản phẩm được làm trong điều kiện vô trùng thiếu hẳn hương vị của nước mắm. Như vậy vi sinh vật tồn tại trong quá trình sản xuất một mặt thúc đẩy nhanh quá trình phân hủy bằng chính enzyme tạo ra mà thành phần quan trọng hơn cả là tạo ra các sản phẩm hình thành hương vị đặc trưng của nước mắm.

Nhiều nhà nghiên cứu khác như Saisithi và cộng sự [27] đã nghiên cứu vai trò vi sinh vật trong quá trình tạo hương nước mắm bằng cách phân tích các hợp chất bay hơi từ nước mắm Thái Lan, Melver và cộng sự [21], Sanceda và cộng sự [28,29] đã tách các thành phần bay hơi trong nước mắm Philippin rồi so sánh chúng trong thành phần nước mắm Nhật Bản, nước mắm Việt Nam. Suphson Chayovan và cộng sự [29] với kết quả phân tích thành phần axit bay hơi và axit không bay hơi, tác giả nhận thấy khó có thể chỉ ra một axit riêng rẽ nào đó mang đặc trưng của hương vị nước mắm. Hương nước mắm là do ảnh hưởng của các yếu tố axit bay hơi và các axit không bay hơi tạo ra trong quá trình lên men. Các hợp chất chứa nitơ có thể đóng vai trò quan trọng trong hương nước mắm. Một khả năng khác cũng được dự đoán là hương nước mắm là kết quả của việc tạo ra các axit bay hơi (acid axetic, acid propionic, acid butyric, acid isobutyric, acid isovaleric) từ chủng vi khuẩn Pediococus halophilus. Hiroshi Itoh [17] cho rằng hàm lượng cao acid axetic, acid lactic trong nước mắm là kết quả của các vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men tạo nên acid lactic.

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu chính phục vụ cho quá trình nghiên cứu là các mẫu chượp ở các giai đoạn khác nhau từ các xí nghiệp sản xuất nước mắm Hải Phòng, Nghệ An, và mẫu chượp được làm tại Viện Công Nghệ Thực phẩm.

Cá cơm được cung cấp bởi cơ sở sản xuất nước mắm Nghệ An

Enzyme protease thương phẩm được lựa chọn để nghiên cứu trong đề tài là enzyme Alacalse, Flavourzyme được cung cấp bởi hãng Novoenzyme (Đan Mạch).

Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều là những hóa chất tinh khiết cho phân tích, cho nghiên cứu về sinh học phân tử hoặc dùng cho thực phẩm có xuất xứ từ Đức, Nhật, Mỹ, Pháp, Trung Quốc.

Dụng cụ: Hộp petri, pipet tự động các loại, ống nghiệm, ống eppendorf, cốc đong, đèn cồn, que cấy, bình tam giác

Thiết bị cơ bản phục vụ thí nghiệm

	Tên thiết bị	Hãng sản xuất
-	Kính hiển vi	Niko, Nhật Bản
-	Máy đo pH	Thuỵ sỹ
-	Tủ ấm, tủ sấy	Liên Xô
-	Máy đo OD	Anh
-	Nồi hấp	Nhật Bản
-	Máy li tâm	Hettich Zentrifugen - Đức
-	Cân điện phân tích	Sartorius- Đức
-	Lò vi sóng	Nhật
-	Buồng cấy vô trùng	Pháp
-	Tủ lạnh	Sanyo- Nhật Bản
-	Bể ổn nhiệt BW 400	Yamato Scientific- Nhật
-	Máy Voltex	Nhật

- Môi trường LB: dùng để nuôi cấy nhóm Bacillus

Thành phần	Khối lượng (g/l)
Cao thịt	5
Pepton	10
Cao men	5
Glucose	20
Aminoxitrat	2
MgSO4.7H2O	0,2
MnSO4.7H2O	0,2
CH3COONa	5
KH2PO4	2
Tween-80	1ml
Agar	14
CaCO3	5
Nước	1000ml
pH	6,2 – 6,5

Pha loãng dung dịch mẫu ở các cấp độ khác nhau 10^-1 đến 10^-7…Tùy theo số lượng vi sinh vật trong mẫu nhiều hay ít mà pha loãng đến nồng độ cần thiết. Sử dụng nước cất đã hấp vô trùng để pha loãng. Lấy 100 µl từ mỗi độ pha loãng cho vào hộp petri chứa môi trường, dàn đều bằng que trang vô trùng, nuôi trong tủ ấm ở 30⁰C, quan sát khuẩn lạc sau 16h, 24h, 36h, 48h

Pha loãng dung dịch mẫu ở các cấp độ khác nhau xử lý ở 80⁰C trong 10 phút Lấy 100 µl từ mỗi độ pha loãng cho vào hộp petri chứa môi trường (1), dàn đều bằng que trang vô trùng, nuôi trong tủ ấm ở 30⁰C, quan sát khuẩn lạc sau 16h, 24h, 36h, 48h.

Pha loãng dung dịch mẫu ở các cấp độ khác nhau. Lấy 100 µl từ mỗi độ pha loãng cho vào hộp petri chứa môi trường PCA có chứa BCP, dàn đều bằng que trang vô trùng, nuôi trong tủ ấm ở 30⁰C, quan sát khuẩn lạc sau 16h, 24h, 36h, 48h. Các khuẩn lạc nào có tạo vòng sinh axit trên môi trường BCP được các định thuộc nhóm vi khuẩn lactic

Nuôi cấy các chủng vi khuẩn trên môi trường thạch thường ở nhiệt độ 37⁰C. Sau 2 ngày, quan sát và mô tả hình thái khuẩn lạc.

Nhuộm Gram và quan sát hình dạng tế bào.

-       Chuẩn bị vết bôi:

-       Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.

-        Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.

-        Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây, rửa nước, thấm khô.

-        Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí. Soi kính: dùng vật kính dầu 100X.

Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ.

Xác định khả năng sinh bào tử

Cấy vi khuẩn trên môi trường thạch thường. Sau 3 ngày tiến hành xử lý nhiệt ở 80⁰C. Dùng vi khuẩn đã xử lý nhiệt cấy lại trên đĩa thạch thường đặt ở 30⁰C. Sau 24 giờ nếu xuất hiện khuẩn lạc thì kết luận chủng vi khuẩn có khả năng sinh bào tử. Nếu không thì kết luận ngược lại.

Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường thạch thường dịch thể, đặt ở 30⁰C. Sau 24 giờ, nhỏ 2 giọt H₂O₂ vào dịch nuôi cấy. Nếu sủi bọt ta kết luận có hoạt tính catalaza. Ngược lại không có hoạt tính

 Phương pháp tách ADN vi khuẩn

- Lấy 2 vòng que cấy vi khuẩn hoà vào 200 l TE trong ống Eppendoft

- Thêm lyzozym vào, trộn đều, sau đó ủ ở 37⁰C trong 30 phút

- Thêm 100 l SDS 10%, ủ ở 37⁰C trong 30 phút

- Thêm 300 l PCI (phenol: chloroform: isoamyl alcohol) vào, trộn đều trong đá lạnh, sau đó ly tâm với vận tốc 15.000 vòng/phút, sau ly tâm, lấy dịch trên (Bước này được lặp lại 2 lần).

- Dùng etanol lạnh với thể tích gấp 2 lần thể tích mẫu để tủa ADN.

- Rửa tủa bằng etanol 70%.

- Làm khô ADN bằng máy làm khô chân không

- Thêm 30-50 l nước, bảo quản để dùng dần.

Điện di trên gel agaroza

Đây là kỹ thuật quan trọng vì đó là cách chủ yếu làm cho các đoạn axit nucleic hiển thị trực tiếp. Phương pháp này dựa trên một đặc tính của axit nucleic là ở pH trung tính mang điện tích âm nhờ các nhóm photphat nằm trên khung photphodieste của các sợi axit nucleic. Điều đó có nghĩa là các phân tử sẽ chạy về cực dương khi đặt trong điện trường. Kỹ thuật này được tiến hành trên một đệm gel có tác dụng phân tách các axit nucleic theo kích thước.

Phản ứng khuếch đại ADN

Mồi xuôi: 5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3' tương ứng với vị trí nucleotit 27 đến 47 của E.coli

Mồi ngược: 5'- AAAGGAGGTGATCCAGCC -3' tương ứng với vị trí nucleotit 1525 đến 1507 của E.coli

- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

 Xác định hàm lượng axit nucleic

Do trong thực tế thường phải sử dụng những lượng axit nucleic rất nhỏ (thường là micro-, nano- hoặc picogram) khi tiến hành các thí nghiệm tách dòng. Không thể xác định số lượng này một cách trực tiếp mà nồng độ của dung dịch axit nucleic được xác định bằng cách đo độ hấp thụ tại bước sóng 260 nm (A₂₆₀) trong máy đo quang phổ kế. Một đơn vị (1,0) giá trị hấp thụ bước sóng 260 nm tương đương với nồng độ 50g/ml của ADN sợi kép, hoặc tương đương với nồng độ 40g/ml của ADN hoặc ARN mạch đơn. Tỉ số A₂₆₀/A₂₈₀ là chỉ số cho thấy độ nhiễm các chất như phenol hoặc protein. Tỷ số A₂₆₀/A₂₈₀ là 1,8 đối với mẫu ADN sạch.