 Phản ứng khuếch đại ADN cho giải trình tự

 Phản ứng khuếch đại ADN cho giải trình tự

Sử dụng bộ kít Cycle sequencing với hỗn hợp phản ứng như sau :

- Chu trình nhiệt:

 Đọc trình tự ADN

Trình tự của rADN 16S của các chủng vi khuẩn được đọc trực tiếp trên máy đọc trình tự tự động ABI 3100 Avant. Sau đó kết quả trình tự được so sánh với các trật tự của các loài đã có trong ngân hàng gen quốc tế để xác định đến tên loài.

c. Xác định mật độ vi sinh vật:

- Phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch:

Vi khuẩn được nuôi cấy lắc 180v/p trong 24h, sau đó tiến hành pha loãng dịch huyền phù đến 10^-7, hút 50µl dịch pha loãng, cấy gạt trên môi trường thích hợp, đặt vào tủ ấm 30 – 32⁰C, sau 24h đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa Petri.

Số lượng khuẩn lạc trong 1ml dịch nuôi cấy được tính theo công thức:

N = a x 1/K x 1/V

a: số khuẩn lạc trung bình mọc trên đĩa thạch

K: nồng độ pha loãng

V: thể tích dịch pha loãng cấy trải trên đĩa thạch

- Phương pháp đo mật độ quang học-OD

Số  lượng tế bào vi sinh vật trong dịch nuôi có thể  xác định gián tiếp bằng cách đo mật độ quang học. Dịch nuôi được pha loãng 5 lần, đo OD ở  bước sóng 620 nm.

Thí nghiệm được kiểm tra trong môi trường MRS, LB với độ mặn 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12% .

Chúng tôi tiến hành lên men trong môi trường lỏng tại các khoảng nhiệt độ được khảo sát là: 20; 25; 30; 35 và 45⁰C. Kết quả được đo sinh khối bằng phương pháp đo mật độ quang học - OD ở bước sóng  = 620nm. Cứ 4h lấy mẫu ra đo một lần. Kết quả cho trên đồ thị 3 ở 28h.

Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của các chủng vi khuẩn trong môi trường MRS và LB lỏng. Dải pH được khảo sát từ 4 – 8, ở nhiệt độ đã lựa chọn, trong 48h. Cứ 4h lấy mẫu đo OD một lần. Kết quả được biểu diễn trên đồ thị 4, ở 28h

Chúng tôi tiến hành khảo sát tỷ lệ tiếp giống trong môi trường lỏng, với các tỷ lệ khác nhau: 1; 3; 5; 7; 10; 15; 20% giống. Với môi trường có pH và nhiệt độ nuôi thích hợp, trong 24h đem đo OD.

Môi trường sơ tuyển là môi trường phân lập có nồng độ muối 10% cộng 0.5% protein (sữa tách béo). Cấy vi khuẩn cần kiểm tra vào chính giữa hộp lồng với môi trường sơ tuyển. Sau thời gian nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp (48 – 72h). Nếu xung quanh vết cấy xuất hiện vòng tròn thuỷ phân trong suốt thì ta nói rằng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp proteaza. Và đo vòng phân giải (D-d;mm) trong đó:

D: Chiều rộng của đường phân giải

d: Độ rộng của khuẩn lạc vi khuẩn

Thống kê kết quả bằng phương pháp ANOVA (chương trình TAGRAPHIC) cho hai nhân tố, với sự kiểm tra mức độ khác biệt có ý nghĩa của nghiệm thức qua kiểm định LSD.

a) Chế biến mẫu chượp bằng cá cơm theo phương pháp thủy phân cá bằng enzyme sau đó bổ sung các chế phẩm vi sinh vật sinh hương

Cá: xay nhỏ, trộn enzyme Flavouyme 0,3%, Alacalse 0,5%, muối 10% cho vào bình gói kín để ở nhiệt độ thường 4 ngày, đưa vào điều kiện tối ưu 50⁰C trong 2 ngày, bổ bổ sung vi sinh vật đã được tuyển chọn vào các mẫu chượp theo tỉ lệ 10⁵ CFU/g nguyên liệu cá, sau 3 ngày thì bổ sung muối một lần, mỗi lần 3% cho đến khi tổng khối lượng muối đủ 25%. Sau khi chượp chín, cảm quan hương thơm nước mắm bằng phương pháp cho điểm.

b) Mẫu đối chứng:

Chế biến mẫu chượp bằng cá cơm theo phương pháp thủy phân cá bằng enzyme không bổ sung các chế phẩm vi sinh vật sinh hương. Các mẫu này được đánh giá cảm quan như mẫu thí nghiệm

Cảm quan mùi hương nước mắm

Chuẩn bị mẫu

Thành lập hội đồng cảm quan gồm 6 thành viên làm việc độc lập

Điểm	Yêu cầu
5	Sản phẩm có mùi thơm rất đặc trưng của nước mắm, dễ chịu
4	Sản phẩm có mùi thơm đặc trưng của nước mắm
3	Sản phẩm có mùi thơm nhẹ của nước mắm
2	Sản phẩm có mùi thơm rất nhẹ của nước mắm
1	Sản phẩm không có mùi thơm của nước mắm, không có mùi lạ
0	Sản phẩm có mùi lạ, hư hỏng

Đánh giá kết quả

2.4.5. Nghiên cứu tỷ lệ bổ sung các chủng vi khuẩn sinh hương trong sản xuất nước mắm

a, Nghiên cứu sự kết hợp các chủng vi khuẩn tới khả năng sinh hương

Các chủng vi khuẩn được được lựa chọn, bổ sung kết hợp vào các mẫu chượp.

Kết hợp hai chủng vi khuẩn theo tỉ lệ 1:1

Kết hợp ba chủng vi khuẩn theo tỉ lệ 1:1:1

Kết hợp bốn chủng vi khuẩn theo tỉ lệ 1:1:1:1

Hỗn hợp vi khuẩn bổ sung vào các mẫu chượp theo tỉ lệ 10⁵ CFU/g nguyên liệu cá. Đánh giá cảm quan hương thơm nước mắm.

Các mẫu chượp được chuẩn bị bao gồm Cá, muối, enzyme. Lượng vi khuẩn bổ sung với các tỉ lệ 10⁴, 10⁵, 10⁶_, 10⁷ CFU/g cá. Đánh giá cảm quan hương thơm nước mắm.

Mẫu xác định thành phần hương được phân tích các cấu tử trên máy GC-MS.

Xử lý mẫu phân tích các cấu tử tạo hương: Lấy 300ml mẫu với 450 ml nước cất, trích ly bằng diethyl ether, làm khan, phân tích trên hệ GC-MS

Chương trình cài đặt phân tích GC-MS

- GC: Injector: 180⁰C; He: 2ml/ phut; Chương trình nhiệt độ 100⁰C – 180⁰C (20⁰C/phút ); lượng mẫu bơm 0.2ul; DB5 (30m x 0,25mm x 0,25um).

- MS: Nguồn Ion: 200 ⁰C, 70 eV; Phổ quét: 30 – 300m/z

R –CH₂N-CH2-COOH +H₂SO₄ NH₃ + CO₂+ SO₂+ H₂O (1)

NH₃ + H₂SO₄ = (NH₄)₂SO₄ (2)

Đuổi amoniac khỏi dung dịch bằng NaOH, đồng thời cất và thu bằng một lượng dư acid boric H₃BO₃ theo phương trình (3) và (4)

(NH₄)₂SO₄ + 2NaOH = Na₂SO₄ + 2H₂O +2NH₃ (3)

2NH₄OH + 4H₃BO₃ = (NH₄)₂B₄O₇ + 7H₂O (4)

Định phân lượng tetraborat amon tạo thành bằng dung dịch H₂SO₄ chuẩn 0,1N qua đó dễ dàng tính được lượng nitơ có trong mẫu vật theo phương trình (5)

(NH₄)₂B₄O₇ + H₂SO₄ + 5H₂O = (NH₄)₂SO₄ + 3H₃BO₃ (5)

Vô cơ hóa mẫu: Cân 100 mg mẫu khô vào bình Kjeldahl sao cho phẩm vật không dính lên thành cổ bình. Cho tiếp vào bình kenđan 10ml H₂SO₄ đậm đặc. Thêm hỗn hợp xúc tác K₂SO₄ : CuSO₄ ( 3:1) có tác dụng làm tăng nhiệt độ sôi của H₂SO₄ và làm tăng cường vận tốc của phản ứng.

Sau khi đã thêm các chất xúc tác, đặt bình vào bộ vô cơ hóa mẫu. Đun cho đến khi dung dịch hoàn toàn mất màu. Trong quá trình đun, thỉnh thoảng lắc nhẹ, tráng khéo sao cho không còn một vết đen nào của mẫu vật thí nghiệm chưa bị phân hủy sót lại trên thành bình. Đun cho đến khi dung dịch trong bình hoàn toàn trắng.

Cất mẫu: Sau khi vô cơ hóa mẫu xong thêm khoảng 150ml nước cất vào bình vô cơ hóa mẫu thêm 2-3 giọt chỉ thị phenolphtalein, tiếp theo thêm khoảng 40 ml NaOH 30-40% dung dịch chuyển sang màu hồng là được. lắp nhanh vào bộ cất thu NH₃, ở bình hứng đã có sẵn 20 ml H₃BO₃ và vài giọt chỉ thị taxiro( chú ý đầu nối cong phải ngập trong dịch). Sau khi cất khoảng 30 phút nhấc bình hứng và kiểm tra lượng NH₃ đã hết chưa bằng giấy quỳ, nếu đã hết ta mang mẫu đi định phân lượng tetraborat amon tạo thành bằng dung dịch H₂SO₄ 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt, ghi lại thể tích H₂SO₄ 0,1N đã chuẩn độ - a .

X = a.1,4.100/m

Trong đó X: hàm lượng nitơ tổng số tính bằng %

a: số ml H₂SO₄ 0,1N dùng định phân

1,4- số mg Nitơ ứng với 1ml H₂SO₄ 0,1N

100 hệ số chuyển sang %

m-lượng mẫu cân tính bằng mg.

c. Phân tích hàm ẩm của mẫu

Cơ sở của phương pháp: Dùng nhiệt để loại bỏ nước ra khỏi mẫu, hiệu số khối lượng cuả mẫu trước và sau khi sấy khô là lượng ẩm có trong mẫu.

Cách tiến hành: Sử dụng máy xác định hàm ẩm Startorius (Đức). Cân 1 g mẫu để vào trong khay giấy bạc, nhấn nút khởi động thiết bị. Lúc này thiết bị sẽ ự động gia nhiệt để đuổi nước ra khỏ mẫu. Đọc kết quả khi quá trình kết thúc.

2. 
   Phân tích lipit theo phương pháp chiết bằng máy soxhlet [9]
   

- Các dung môi để chiết chất béo là ete etylic, ete petrol...thường có trọng lượng riêng nhỏ, nhiệt độ sôi thấp cho phép chiết nhanh chóng chất béo

- Tốc độ và mức độ chiết chất béo hoàn toàn phụ thuộc vào mức độ nghiền nhỏ của nguyên liệu thí nghiệm và bản chất dung môi

Cách tiến hành: Cân lấy vào ống giấy 10 g nguyên liệu đã xay nhỏ và sấy khô đến trọng lượng không. Chuyển vào trụ chiết. Thêm dung dịch chiết vào với thể tích gấp 1,5 đến 2 lần thể tích trụ chiết - a). Mở nước làm mát vào ống sinh hàn và bắt đầu chiết. Để cho ete sôi không quá mạnh, nhiệt độ khoảng 45-50⁰C, tốc độ chiết sao cho số lần trút ete từ trụ chiết vào bình chiết khoảng 10-15 lần trong 1 giờ. Quá trình chiết kết thúc khi nhỏ một vài giọt ete từ đầu mút của trụ chiết lên kính, nếu sau khi ete bay hơi hết mà không còn để lại vết chất béo nào trên kính thì xem như chất béo đã được chiết hoàn toàn và quá trình chiết kết thúc. Khi chiết xong lấy bình cầu có chứa chất béo hòa tan ra khỏi thiết bị soxlet, lắp ống sinh hàn vào cất ete. Sấy bình đến trọng lượng không đổi rồi đem cân -b. Thường khi chiết bằng ete etylic thì sấy ở nhiệt độ 60-70⁰C trong 30 phút, còn khi chiết bằng ete petrol sấy ở nhiệt độ 80-90⁰C trong 45-50 phút.

Tính kết quả: Hàm lượng chất béo tính theo công thức sau:

X = (b-a).100/m(100-w)

Với X - hàm lượng chất béo tính bằng %

a- trọng lượng bình không, g

b- trọng lượng bình và chất béo, g

m- trọng lượng mẫu nguyên liệu thí nghiệm, g

w-độ ẩm của mẫu nguyên liệu, %

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Xác định thành phần nguyên liệu cá

Cá sử dụng cho thí nghiệm là cá cơm, được sử dụng làm nguyên liệu sản xuất chính cho nước mắm tại Công ty Cổ phần thủy sản Nghệ An.

Cá sau khi thu mua, bảo quản lạnh trong hộp xốp kín, chuyển tới phòng thí nghiệm Viện Công nghiệp thực phẩm.

Trước khi thí nghiệm, cá được rửa sạch, để ráo nước, xay nhỏ, trộn đều, được đưa đi phân tích để xác định các chỉ tiêu như: hàm ẩm, hàm lượng protein tổng, hàm lượng lipid. Kết quả phân tích được thể hiện trên bảng 3.1

Với mục đích phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh hương để ứng dụng cho quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày có sử dụng enzyme protease, do vậy nguyên liệu cá sử dụng cho thí nghiệm được xử lý như sau:

- Mẫu đối chứng: thuỷ phân nguyên liệu cá bằng enzyme sau đó tàng trữ lên men: Cá xay nhỏ, trộn enzyme Flavourzyme 0,3%, Alacalse 0,5%, muối 10% cho vào bình gói kín để ở nhiệt độ thường 4 ngày, đưa vào điều kiện tối ưu 50⁰C trong 2 ngày, sau 3 ngày thì bổ sung muối một lần, mỗi lần 3% cho đến khi tổng khối lượng muối đủ 25%. Sau quá trình thuỷ phân, nguyên liệu được tàng trữ cho quá trình lên men, rút dịch tạo sản phẩm nước mắm ngắn ngày không bổ sung vi sinh vật gây hương.

-Mẫu thí nghiệm - Mẫu thuỷ phân nguyên liệu cá bằng enzyme sau đó bổ sung chế phẩm vi sinh vật gây hương trong quá trình tàng trữ lên men: điều kiện thủy phân cá tương tự mẫu đối chứng. Sau quá trình thuỷ phân, bổ sung chế phẩm vi sinh vật và tàng trữ cho quá trình lên men rút dịch tạo sản phẩm nước mắm ngắn ngày có bổ sung vi sinh vật gây hương.

Việc bổ sung vi khuẩn có khả năng phân giải protein đồng thời tạo hương sản phẩm là rất cần thiết đối với quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày nhằm tăng thêm hương vị cho sản phẩm tương tự với sản phẩm nước mắm lên men theo phương pháp truyền thống. Các vi sinh vật tạo hương đồng thời có khả năng sinh tổng hợp enzyme proteaza sẽ làm tăng thêm hiệu suất thuỷ phân đạm trong khối chượp trong quá trình lên men, nâng cao chất lượng cho sản phẩm.

Từ 15 mẫu chượp ở các giai đoạn khác nhau được thu thập tại các cơ sở sản xuất đã được phân lập, kiểm tra, làm sạch chọn ra được 120 chủng vi khuẩn.

Từ 120 chủng này, chúng tôi sơ tuyển chọn ra các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải protein mạnh trên môi trường có nồng độ muối cao, bằng cách cấy vi khuẩn cần kiểm tra vào hộp lồng với môi trường sơ tuyển (môi trường phân lập có nồng độ muối 10% được bổ sung 0.5% sữa tách béo). Sau thời gian nuôi cấy ở nhiệt độ và thời gian thích hợp (48 – 72h), các khuẩn lạc có khả năng tạo vòng thủy phân protein được đánh giá mức độ thủy phân. Kết quả sơ tuyển được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2: Khả năng sinh enzyme proteaza của 120 chủng vi sinh vật phân lập tính theo số chủng và đơn vị %

Hoạt tính enzyme	Proteaza
	Số chủng	Tỉ lệ phần trăm (%)
Mạnh	10	8
Trung bình	22	18
Yếu	17	14
Không có	91	76

Ghi chú:

+ Không có hoạt tính enzyme khi vòng phân giải (D – d, mm) ≤ 1mm

+ Hoạt tính enzyme yếu khi vòng phân giải (1mm < (D – d, mm) ≤ 10mm

+ Hoạt tính enzyme mạnh khi vòng phân giải (10mm < (D – d, mm)

Kết quả bảng 3.2 cho thấy: Trong 120 chủng vi sinh vật được phân lập có hoạt tính proteaza ở mức độ phân giải khác nhau, có rất nhiều chủng không có hoạt tính proteaza ở môi trường có nồng độ muối cao.

Chúng tôi tuyển chọn 10 chủng có khả năng phân giải proteaza mạnh để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

3.2.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh hương, sinh proteaza, chịu mặn cho sản xuất nước mắm ngắn ngày.

Cá xay nhỏ, trộn enzyme Flavouyme 0,3%, Alacalse 0,5%, muối 10% cho vào bình gói kín để ở nhiệt độ thường 4 ngày, đưa vào điều kiện tối ưu 50⁰C trong 2 ngày, bổ sung vi sinh vật đã tuyển chọn 10⁵ CFU/g , sau 3 ngày thì bổ sung muối một lần, mỗi lần 3% cho đến khi tổng khối lượng muối đủ 25%. Thí nghiệm gồm 11 mẫu kí hiệu Mẫu 0 (mẫu đối chứng), Mẫu 1, Mẫu 2, Mẫu 3, Mẫu 4, Mẫu 5, Mẫu 6_, Mẫu 7_, Mẫu 8, Mẫu 9, Mẫu 10. Các mẫu nước mắm có bổ sung vi khuẩn lần lượt là L14, L15, L18, L22, B9, B13, B16, B26, B28, B36. Chượp chín, tiến hành đánh giá cảm quan mùi nước mắm.

Hội đồng cảm quan gồm 6 cảm quan viên, ngửi và cho điểm theo bảng điểm đánh giá cảm quan về mùi nước mắm. Kết quả đánh giá cảm quan được thể hiện trên bảng 3.3

Bảng 3.3. Kết quả cảm quan mùi nước mắm khi bổ sung vi sinh vật

Mẫu	Mùi nước mắm (Giá trị trung bình)
Mẫu 0	1,333a
Mẫu 1	1,167a
Mẫu 2	1,5a
Mẫu 3	2,333b
Mẫu 4	2,167b
Mẫu 5	2,167b
Mẫu 6	1,5a
Mẫu 7	1,333a
Mẫu 8	1,333a
Mẫu 9	2,167b
Mẫu 10	1,333a

F=5,19

P= 0,0000

Các số liệu trong bảng sự khác biệt thống kê chỉ có ý nghĩa theo cột. Các trị số có chữ đi kèm giống nhau khác biệt không có ý nghĩa ở mức 5%.
Qua kết quả thống kê bảng 3.3 ta thấy, các chủng vi sinh vật tuyển chọn có khả năng tạo hương rất khác nhau khi phát triển trên môi trường chượp cá thủy phân bằng enzyme thương phẩm. Các mẫu được bổ sung các chủng L18, L22, B9, B28 và các chủng còn lại có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê.

Từ các kết quả thu được, chúng tôi tiến hành chọn 4 chủng vi sinh vật có khả năng sinh hương tốt nhất để tiếp tục nghiên cứu.

Phân loại vi sinh vật nói chung và vi khuẩn nói riêng là công việc ban đầu để biết tên của các chủng vi sinh vật nghiên cứu. Việc xác định chính xác tên phân loại của một chủng vi sinh vật có ý nghĩa quan trọng cho mọi nghiên cứu khai thác và sử dụng chúng cho các mục đích khác nhau, đặc biệt đối với ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.

Quan sát đặc điểm hình thái, nhuộm Gram, xác định hoạt tính catalaza của 04 chủng đã được tuyển chọn. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4.

Kí hiệu chủng	Đặc điểm
B9	- Khuẩn lạc: bề mặt khuẩn lạc nhăn, mép hơi bóng và trong. Kich thước 1.5-3mm - Tế bào hình que, hai đầu hơi tròn. - Gram (+) - Sinh bào tử - Catalaza (+)
B28	- Khuẩn lạc: tròn hoặc dài, màu trắng đục, mép xẻ thùy, bề trên mặt khuẩn lạc tạo bờ nhỏ, khi già tạo nếp nhăn lớn, kích thước 1-2.5mm. - Tế bào hình que, hơi mảnh, đứng riêng rẽ - Gram (+) - Sinh bào tử - Catalaza (+)
L18	- Khuẩn lạc: Tròn, nhỏ, trắng sữa, kích thước 0,4 – 0,8 mm Tế bào hình que Gram (+) - Không sinh bào tử - Catalaza (-)
L22	- Khuẩn lạc: Tròn, trắng bóng, kích thước 0,3- 0,5 mm - Tế bào hình que, đứng riêng rẽ hoặc từng đôi một. - Gram (+) - Không sinh bào tử - Catalaza (-)

Căn cứ vào kết quả bảng 3.4 kết hợp với khóa phân loại Bergey (1994) có thể kết luận 2 chủng B9, B28 đều thuộc chi Bacillus, 2 chủng L18 và L22 thuộc chi Lactobacillus

Khi đưa các chủng vi sinh vật sống vào môi trường cần phải đảm bảo chắc chắn rằng chủng đó không gây hậu quả xấu đối với sức khỏe con người và môi trường. Do vậy cần tiến hành xác định trình tự 16S rADN để định danh chính xác đến loài.

- Tách ADN tổng số và nhân đoạn 16S rADN

Tiến hành tách ADN và điện di kiểm tra trên gel agarose: Kiểm tra sản phẩm điện di trên gel agarose 1% cho thấy trên bản gel thu được băng ADN tổng số duy nhất, trong đó có rADN 16S.

- Xây dựng cây phân loại theo trình tự gen 16S rARN:

Tiến hành xây dựng cây phân loại dựa vào các trình tự gen 16S rARN đã biết của các chủng đã có trên ngân hàng gen.

Trình tự gen 16S rRNA của chủng B9 có độ tương đồng 99,8% (1419/1422 bp) với gen 16S rRNA của Bacillus velezensis và Bacillus vallismortis; tương đồng 99,6% (1417/1422 bp) với Bacillus nematotocita; tương đồng 99,6% (1416/1422 bp) với Bacillus subtilis; tương đồng 99,5% (1415/1422 bp) với Bacillus mojavensis, Brevibacterium halotolerans và Bacillus axarquiensis. Chủng B9 thuộc nhóm Bacillus subtilis

Trình tự gen 16S rRNA của chủng B28 có độ tương đồng 99,8% (1419/1422 bp) với gen 16S rRNA của Bacillus velezensis; tương đồng 99,6% (1417/1422 bp) với Bacillus vallismortis; tương đồng 99,6% (1416/1422 bp) với Bacillus subtilis; tương đồng 99,5% (1415/1422 bp) với Bacillus nematotocita; tương đồng 99,4% (1413/1422 bp) với Bacillus mojavensis, Brevibacterium halotolerans và Bacillus axarquiensis. Chủng B28 thuộc nhóm Bacillus subtilis

Vị trí phân loại của chủng B28 và các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự gen 16S rRNA

Trình tự gen 16S rRNA của chủng L22 có độ tương đồng 100% (1500/1500 bp) với gen 16S rRNA của L. pentosus, 99,9% (1499/1500 bp) với gen 16S rRNA của L. plantarum và L. arizonensis, 99,7% (1496/1500 bp) với gen 16S rRNA của L. paraplantarum.

Trình tự gen 16S rRNA của chủng L18 có độ tương đồng 100% (1500/1500 bp) với gen 16S rRNA của L. pentosus; 99,9% (1499/1500 bp) với gen 16S rRNA của L. plantarum và L. arizonensis, 99,7% (1496/1500 bp) với gen 16S rRNA của L. paraplantarum.

Kết quả cho thấy các chủng L18 và L22 có độ tương đồng gen 16S rRNA là 99.8%-100% so với gen 16S rRNA của các loài vi khuẩn L. pentosus, L. plantarum, L. arizonensis. Như vậy rất khó có thể kết luận được chúng thuộc chính xác loài nào nếu chỉ dựa trên trình tự gen 16S rRNA. Theo Kostinek và cộng sự, L. arizonensis là một dạng của L. plantarum do có trình tự gen 16S rRNA tương đồng 99.7-99.9%, đồng thời có mức độ tương đồng ADN >70% khi tiến hành lai ADN-ADN (Kostinek et al., 2005). Đối với L. plantarum, L. paraplantarum và L. pentosus, để phân biệt các loài này cần sử dụng một số kỹ thuật phân tử khác như lai ADN-ADN (Zanoni et al., 1987; Curk et al., 1996), lai với các gen đặc hiệu như pyrDEF (Bringel et al., 1996), hay phân tích trình tự gen đặc hiệu recA (Torriani et al., 2001). Do điều kiện không cho phép, chúng tôi chưa thể tiến hành phân loại các chủng dựa vào các gen đặc hiệu trên. Tuy nhiên theo một số nghiên cứu trước đây, L. pentosus thường lên men xyloza trong khi L. plantarum và L. paraplantarum không lên men nguồn cacbon này (Kandler & Weiss, 1986; Zanoni et al., 1987; Swezey et al., 2000). Khác với L. plantarum và L. paraplantarum, L. pentosus thường lên men glycerol (Zanoni et al., 1987; Bringel et al., 1996; Curk et al., 1996). Chủng L18 và L22 có thể thuộc loài L. plantarum

Kết luận: - Chủng B9, B28 thuộc nhóm Bacillus subtilis

- Chủng L18 và L22 có thể thuộc loài L. plantarum