Nghiên cứu tỷ lệ bổ sung các chủng vi khuẩn sinh hương trong sản xuất nước mắm

Các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn được phối hợp theo tỉ lệ 1:1, 1:1:1 và 1:1:1:1 để bổ sung vào các mẫu chượp nước mắm lên men ngắn ngày theo tỉ lệ chọn 10⁵ CFU/g cá.

Mẫu 0: Mẫu đối chứng không bổ sung vi khuẩn sinh hương.

Mẫu 1: L. plantarum(L18) + L. plantarum (L22)

Mẫu 2: L. plantarum (L18) + B. subtilis (B9)

Mẫu 3: L. plantarum(L18) + B. subtilis (B28)

Mẫu 4: L. plantarum (L22) + B. subtilis (B9)

Mẫu 5: L. plantarum (L22) + B. subtilis (B28)

Mẫu 6: B. subtilis (B9) + B. subtilis (B28)

Mẫu 7: L. plantarum(L18) + L. plantarum (L22) + B. subtilis (B9)

Mẫu 8: L. plantarum(L18) + L. plantarum (L22) + B. subtilis (B28)

Mẫu 9: L. plantarum (L22) + B. subtilis (B9) + B. subtilis (B28)

Mẫu 10: L. plantarum(L18) + B. subtilis (B9) + B. subtilis (B28)

Mẫu 11: L. plantarum(L18) + L. plantarum (L22) + B. subtilis (B9) + B. subtilis (B28)

Kết quả đánh giá cảm quan được thể hiện trên bảng 3.5
Bảng 3.5: Kết quả cảm quan hương nước mắm

khi bổ sung kết hợp vi sinh vật

Mẫu	Mùi nước mắm (Giá trị trung bình)
Mẫu 0	1.5a
Mẫu 1	2.167b
Mẫu 2	2.333bc
Mẫu 3	2.333bc
Mẫu 4	2.5bcd
Mẫu 5	2.5bcd
Mẫu 6	2.667bcde
Mẫu 7	2.833cde
Mẫu 8	2.667bcde
Mẫu 9	3.0de
Mẫu 10	2.833cde
Mẫu 11	3.167e

F= 4,68

P= 0,0001

Các số liệu trong bảng sự khác biệt thống kê chỉ có ý nghĩa theo cột. Các trị số có chữ đi kèm giống nhau khác biệt không có ý nghĩa ở mức 5%.
Kết quả thống kê bảng 3.5 đã chỉ ra ảnh hưởng khi kết hợp bổ sung các chủng vi sinh vật vào chượp cá thuỷ phân bằng enzyme thương phẩm cho cường độ mùi nước mắm là hoàn toàn khác nhau. Mẫu 0 (mẫu đối chứng) mùi thơm kém hơn các mẫu nước mắm có bổ sung vi khuẩn sinh hương, với các mẫu bổ sung kết hợp 2 hay 3 chủng vi khuẩn sản phẩm nước mắm có hương thơm tương đối tốt. Tuy nhiên riêng mẫu 11 có hương thơm tốt nhất là mẫu nước mắn ngắn ngày được bổ sung kết hợp của bốn chủng vi khuẩn, có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê với các mẫu khác. Vì vậy chúng tôi tiến hành chọn sự kết hợp 4 chủng vi sinh vật để bổ sung vào nước mắm

3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng tỉ lệ vi khuẩn bổ sung đến khả năng sinh hương

Để nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ vi khuẩn bổ sung đến mùi nước mắm, chúng tôi tiến hành bổ sung kết hợp cả 4 chủng vi khuẩn với tỉ lệ 1:1:1:1 với số lượng vi khuẩn là 10⁴, 10^5, 10⁶, 10⁷ CFU/g nguyên liệu cá. Kết quả đánh giá cảm quan được chỉ ra tại bảng 3.6

Kết quả thống kê bảng 3.5 chỉ ra ảnh hưởng tỉ lệ vi khuẩn bổ sung đến mùi nước mắm cho ta thấy mẫu 2, mẫu 3 và mẫu 4 không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê. Như vậy với tỉ bổ sung vi khuẩn 10^5, 10⁶, 10⁷ CFU/g nguyên liệu cá mùi nước mắm không có sự khác biệt. Vì vậy chúng tôi chọn tỉ lệ bổ sung vi khuẩn là 10⁵ CFU/g.

Với mục đích của đề tài là lựa chọn ra các vi khuẩn có khả năng sinh hương tốt, có khả năng ứng dụng cho quy trình sản xuất nuớc mắm ngắn ngày sử dụng chủ động enzyme proteaza thương phẩm. Do vậy trong nội dung này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các điều kiện sinh trưởng thích hợp cho vi khuẩn sinh trưởng và phát triển để thu sinh khối với khối lượng nhiều nhất, nhằm ứng dụng cho sản xuất tạo chế phẩm vi sinh vật gây hương. Chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố: nhiệt độ, pH, tỉ lệ tiếp giống và khả năng chịu nặm của các chủng vi khuẩn

Nhiệt độ là yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự phát triển và thời gian thu sinh khối của vi khuẩn. Ở nhiệt độ thấp sẽ kéo dài thời gian sinh trưởng do đó kéo dài thời gian thu sinh khối. Còn ở nhiệt độ quá cao chủng sẽ bị ức chế. Với mục đích thu sinh khối lớn trong thời gian ngắn ta cần tìm nhiệt độ tối thích nhất cho chủng phát triển.

Để tìm khoảng nhiệt độ tối thích chúng tôi tiến hành lên men trong môi trường MRS và môi trường LB tại các khoảng nhiệt độ được khảo sát là: 20; 25; 30; 35 và 45⁰C. Kết quả được đo sinh khối bằng phương pháp đo mật độ quang OD ở bước sóng  = 620nm. Cứ 4 giờ lấy mẫu ra đo một lần. Kết quả được thể hiện trên hình 3.1, thu sinh khối sau 28 giờ nuôi.



Hình 3.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến 4 chủng vi khuẩn

Từ hình 3.1 ta thấy rằng nhiệt độ ảnh hưởng không nhiều đến quá trình sinh trưởng của cả bốn chủng L. plantarum (L18), L. plantarum(L22), B. subtilis (B9) và B. subtilis (B22)

Đối với chủng L. plantarum (L22) nhiệt độ tối thích cho sự phát triển của chủng là 30 - 40⁰C, ở 20⁰C chủng phát triển kém hơn và thời gian phát triển kéo dài, để đạt đến pha cân bằng mất trên 30 giờ.

Chủng L. plantarum (L18) ta thấy nhiệt độ tối thích cho chủng phát triển từ 32 – 37⁰C. Ở 20 - 25⁰C chủng L. plantarum (L18) cũng vẫn phát triển được nhưng yếu hơn và thời gian để tiến tới pha cân bằng kéo dài. Do vậy để đáp ứng mục tiêu của sản xuất là sinh khối chúng tôi chọn nhiệt độ 35⁰C là nhiệt độ thích hợp cho chủng phát triển.

Chủng B. subtilis (B9) nhiệt độ tối thích cho chủng phát triển là 30 - 35⁰C, với nhiệt độ 20 – 25⁰C và 35 – 45⁰C chủng cũng phát triển được.

Đối với chủng B. subtilis (B28): Nhiệt độ tối thích cho chủng phát triển là 28 – 33⁰C, ở nhiệt độ 30⁰C chủng phát triển tốt hơn, nhưng hầu như nhiệt độ không ảnh hưởng đến quá trình phát triển của chủng.

Kết luận cả 4 chủng vi khuẩn đều là các vi khuẩn ưa ấm.

3.4.2. Ảnh hưởng của pH

Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của 2 chủng L. plantarum (L18) và L. plantarum (L22) trong môi trường MRS lỏng, 2 chủng B. subtilis (B9) và B. subtilis (B28) trong môi trường LB lỏng với điều kiện nhiệt độ tối thích cho mỗi chủng. Dải pH được khảo sát từ 4 – 8, trong 48 giờ nuôi cấy. Cứ 4 giờ lấy mẫu đo OD một lần.

Kết quả được biểu diễn trên hình 3.2, sau 28 giờ nuôi cấy.

Hình 3.2: Ảnh hưởng của pH đến chủng vi khuẩn

Từ hình 3.2 ta thấy rằng pH ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng của cả 4 chủng.

Đối với chủng L. plantarum (L18) có thể phát triển tốt ở pH hơi axit. Phát triển tối thích ở pH = 6 – 6,5, pH 7- 8 sự phát triển của chủng kém hơn.

Chủng L. plantarum (L22) thích hợp với khoảng pH rộng, phát triển tối thích ở pH = 5,5 – 7, tốt nhất ở pH = 6. Khoảng pH từ 4 – 4.5 và pH 7.5 - 8 chủng vẫn phát triển được.

Qua khảo sát ta thấy rằng chủng B. subtilis (B9) phát triển tốt ở pH trung tính và hơi kiềm. pH 4-5 chúng phát triển kém. Điều đó chứng tỏ chủng rất thích hợp phát triển trong môi trường nước biển.

pH 4-5 chủng B. subtilis (B28) phát triển chậm, phát triển tối thích ở pH = 6,5- 7,5, tốt nhất ở pH 7

Dựa vào sự khảo sát pH chúng tôi chọn pH = 6-7,5 và pH = 5,5-6,5 làm pH môi trường cho quá trình lên men thu sinh khối 2 chủng vi khuẩn L. plantarum ( L18) và L. plantarum (L22). Còn 2 chủng B. subtilis (B9) và B. subtilis (B28) pH thích hợp là pH = 6,5-7,5 để thu sinh khối
3.4.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống

Tỷ lệ tiếp giống ảnh hưởng đến thời gian nuôi cấy và hiệu quả kinh tế. Để có thời gian nuôi cấy thích hợp và lượng sinh khối như mong muốn ta cần tìm tỷ lệ tiếp giống thích hợp cho hiệu quả cao nhất. Nếu tỷ lệ tiếp giống quá thấp sẽ kéo dài thời gian nuôi cấy và rất dễ bị nhiễm các vi sinh vật tạp khác. Tỷ lệ giống quá cao, thời gian thu sinh khối nhanh nhưng do chủng phát triển quá nhanh làm thức ăn nhanh chóng cạn kiệt và chúng sinh ra một số sản phẩm gây ức chế quá trình sinh trưởng của chính chúng.

Chúng tôi tiến hành khảo sát tỷ lệ tiếp giống trong môi trường MRS, LB lỏng, có pH và nhiệt độ nuôi thích hợp, với các tỷ lệ khác nhau: 1; 3; 5; 7; 10; 15; 20% giống. Sau 24 giờ nuôi cấy, dịch nuôi được đánh giá độ đục theo phương pháp đo OD. Kết quả được thể hiện trên hình 3.3.



Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống đến các chủng vi sinh vật
Trên hình 3.3 ta thấy rõ rằng tỷ lệ giống không ảnh hưởng đến hiệu suất thu sinh khối của chủng L. plantarum (L22). Do đó chúng tôi chọn tỷ lệ tiếp giống cho chủng L. plantarum (L22) là 1 – 5% giống.

Đối với chủng L. plantarum (L18) ở tỷ lệ giống từ 5 – 10% lượng sinh khối là như nhau. Với tỷ lệ giống 15 – 20% chủng phát triển tỷ lệ thuận với lượng giống cấy vào nhưng với tỷ lệ này chi phí cho môi trường nhân giống qúa lớn. Do đó chúng tôi chọn tỷ lệ cấy giống cho chủng L. plantarum (L18) là 5 – 10%.

Chủng B. subtilis (B9) và chủng B. subtilis (B28) tỉ lệ giống từ 3 – 20% lượng sinh khối tương đương nhau, còn với tỷ lệ 1% chủng phát triển kéo dài thời gian để đạt tới lượng sinh khối cần thiết. Do đó chúng tôi chọn tỉ lệ tiếp giống cho hai chủng này là 3-7%

Bảng 3.7 thể hiện các kết quả nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp với 04 chủng vi khuẩn thí nghiệm

Với mục đích ứng dụng các chủng vi khuẩn cho sản xuất các chế phẩm vi sinh sinh hương cho nước mắm, các chủng thí nghiệm cần phải phát triển và duy trì được các đặc tính sinh học của mình trong điều kiện môi trường có nồng độ muối cao. Do vậy, khả năng chịu mặn của các chủng L. plantarum (L18), L. plantarum (L22), B. subtilis (B9) và B. subtilis (B28) đã được kiểm tra

Thí nghiệm với hai chủng L. plantarum (L18), L. plantarum (L22) được kiểm tra trong môi trường MRS, chủng B. subtilis (B9) và B. subtilis (B28) được kiểm tra trên môi trường LB với độ mặn khác nhau. Kết quả thu được đã được thể hiện trên hình 3.4



Hình 3.4 : Khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn

Từ hình 3.4 ta thấy rằng hầu hết các chủng đều phát triển tỉ lệ nghịch với độ mặn của môi trường.

Chủng L. plantarum (L18) và chủng L. plantarum (L22) phát triển rất tốt ở nồng độ muối 2 - 6%. Ở nồng độ muối 8-10% chủng này vẫn phát triển tương đối tốt.

Chủng B. subtilis (B9) và B. subtilis (B28): Ta thấy chủng có thể chịu được độ mặn 8-10%. Sự phát triển của chủng tỷ lệ nghịch với độ mặn của môi trường. Còn ở độ mặn 12% chủng cũng phát triển nhưng kém hơn.

Như vậy có thể khẳng định 4 chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặn khá tốt, đây là đặc tính quý khi sử dụng các chủng này làm chế phẩm cho nước mắm.

3.5. Động học quá trình phát triển của các chủng vi khuẩn sinh hương trong điều kiện cấy thích hợp.

Xác định đường cong sinh trưởng của các chủng giúp ta kiểm soát quá trình nuôi cấy và xác định thời gian thích hợp nhất cho quá trình thu sinh khối.

Chúng tôi tiến hành xác định đường cong sinh trưởng ở môi trường MRS, LB lỏng, pH và nhiệt độ nuôi cấy thích hợp. Chúng tôi tiến hành nuôi mẫu ở các thời điểm 0, 4, 10, 14, 20, 24, 30, 34, 40 và 48 giờ, xác định giá trị mật độ quang ở bước sóng 620nm. Kết quả đường cong tăng trưởng của các chủng vi sinh vật ở các thời điểm khác nhau được biểu diễn trên các hình 3.5, 3.6, 3.7, 3.8.

a) Chủng L. plantarum (L18)

Nhìn vào hình 3.5 có thể thấy chủng L. plantarum (L18) đạt đến pha cân bằng ở 16 giờ. Mật độ tế bào đạt giá trị lớn nhất ở 20 – 40 giờ. Ở 42 – 48giờ tế bào bắt đầu già và chết dần. Nhự vậy ta có thể thu sinh khối ở 22 – 28 giờ.

Dựa vào đồ thị chúng tôi nhận thấy từ thời điểm 20 – 30 giờ chủng L. plantarum (L22) đi vào pha ổn định, và thời điểm 32 – 48 giờ là giai đoạn suy tàn. Vì vậy có thể thu sinh khối chủng L. plantarum (L22) ở thời điểm 24 – 26 giờ.

Đồ thị cho thấy chủng B. subtilis (B9) đạt đến pha cân bằng ở thời điểm 22 – 40 giờ. Sinh khối của chủng đạt cực đại ở thời điểm 24 – 30 giờ. Ta có thể thu sinh khối chủng B9 ở thời điểm 24 – 26 giờ.

Với các đồ thị của cả 4 chủng ta thấy tất cả chủng đều bỏ qua giai đoạn thích ứng. Điều này dễ giải thích bởi môi trường hoạt hóa giống không khác với môi trường lên men.

Giai đoạn phát triển logarit ngắn, điều này có lợi cho quá trình sản xuất thu sinh khối. Rút ngắn được thời gian lên men.

Giai đoạn cân bằng dài chứng tỏ chủng có khả năng duy trì sinh trưởng tốt. Điều này thuận lợi cho quá trình sản xuất xử lý thu sinh khối

Để thể hiện tính đúng đắn và xác thực của những kết quả nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành so sánh sự khác biệt về các cấu tử hương giữa hai sản phẩm nước mắm lên men ngắn ngày bằng phương pháp phân tích các cấu tử hương trên thiết bị GC-MS với các loại mẫu như sau:

- M1 (Mẫu thí nghiệm): Sản phẩm nước mắm có bổ sung hỗn hợp 4 chủng vi khuẩn sinh hương .

- M2 (Mẫu đối chứng): Sản phẩm nước mắm không bổ sung vi khuẩn sinh hương.

Kết quả phân tích GC-MS thành phần tạo hương được thể hiện trên bảng 3.8 với hai mẫu nước mắm ngắn ngày sử dụng enzyme proteaza thương phẩm có bổ sung vi sinh vật và mẫu không bổ sung vi sinh vật

Dựa trên kết quả phân tích, ở hai mẫu có sự lặp lại một số cấu tử tạo hương. Cả hai mẫu nước mắm đều có cấu tử tạo hương butanoic acid là axit góp phần đáng kể vào “mùi bơ” trong các sản phẩm lên men phomat.

Tuy nhiên, mẫu nước mắm thí nghiệm được bổ sung vi sinh vật có 10 cấu tử tạo hương, còn ở mẫu không bổ sung vi sinh vật chỉ có 5 cấu tử tạo hương như vậy khi bổ sung vi khuẩn vào quá trình thủy phân nước mắm đã làm thay đổi về thành phần các cấu tử tạo hương. Chứng tỏ rằng mẫu nước mắm có bổ sung vi khuẩn đã giúp cho quá trình chuyển hóa các axit amin trong protein của cá thành các axit bay hơi tạo mùi hương cho nước mắm

1. 
   Đã phân lập, tuyển chọn và định tên được 04 chủng vi khuẩn có khả năng sinh proteaza trong môi trường có nồng độ muôi cao đồng thời có khả năng tạo mùi thơm nước mắm là chủng L18, L22 thuộc loài L. plantarum, B9, B28 thuộc loài Bacillus subtilis.
   
2. 
   Đã lựa chọn được điều kiện kết hợp 04 chủng vi khuẩn cho khả năng tạo mùi tốt nhất với tỉ lệ bổ sung vào chượp cá là 10⁵CFU/g nguyên liệu cá
   
3. 
   Đã đánh giá, so sánh sản phẩm thí nghiệm có bổ sung vi sinh vật với sản phẩm đối chứng không bổ sung vi sinh vật. Kết quả mẫu thí nghiệm có mùi vị tốt hơn so với sản phẩm đối chứng