Các tác giả Chương 1 Các đại phân tử sinh học I. Nucleic acid

Nói chung, có ba cách thường được dùng để xác định mức độ biểu hiện protein ngoại lai của gen được tạo dòng:

- Điện di polyacrylamide gel có SDS để xác định protein có kích thước thích hợp được sản xuất ở mức độ cao trong các tế bào mang vector biểu hiện. Thông thường, protein quan tâm có thể quan sát bằng cách nhuộm gel với Coomassie Brilliant Blue hoặc bằng AgNO₃. Nếu không thấy có băng protein mới khi dùng các thuốc nhuộm này, thì đánh dấu sự trao đổi chất với 100 µCi của [³⁵S]Met hoặc [³⁵S]Cys trên 1 mL dịch nuôi cấy trong 5 phút. Sau đó, sử dụng kỹ thuật SDS-PAGE hoặc phóng xạ tự ghi có thể phát hiện được protein quan tâm.

- Phân tích Western blot bằng cách dùng các kháng thể liên kết đặc hiệu với protein quan tâm đã được thẩm tích lên màng nitrocellulose sau khi thực hiện điện di SDS-polyacrylamide gel.

- Nếu mức độ biểu hiện thấp thì nên đặt gen lacZ cùng hướng với gen được biểu hiện. Như vậy, nếu sự phiên mã hoặc dịch mã hạn chế biểu hiện thì những thay đổi trong hệ thống biểu hiện có thể được kiểm soát bằng những thay đổi trong hoạt tính của β-galactosidase.

▪ Phân tích Western blot

Là kỹ thuật điện di trên polyacrylamide gel với sự có mặt của SDS cho phép phân tách các phân tử protein có khối lượng khác nhau. SDS có điện tích âm rất lớn và có khả năng liên kết với mạch peptide. Như vậy, số lượng SDS tương tác với protein tỷ lệ với kích thước phân tử protein và điện tích của SDS bám vào có thể làm bất cứ phân tử protein nào cũng chuyển động trong điện trường từ cực âm sang cực dương. Do đó, bằng phương pháp điện di, có thể phân tách riêng biệt các phân tử protein có khối lượng phân tử khác nhau.

Phản ứng kháng nguyên-kháng thể có tính đặc hiệu rất cao. Vì vậy, có thể áp dụng phản ứng này để phát hiện sự có mặt và tinh sạch protein. Kháng thể (antibody) được sản xuất khi đưa kháng nguyên vào động vật thí nghiệm (thỏ, chuột…) và được tinh sạch từ máu động vật sau khi gây nhiễm. Những kháng thể tạo ra bằng cách này là những kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies-do các tế bào lympho khác nhau tiết ra), do đó chúng có khả năng nhận biết một số kháng nguyên. Ngược lại, kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies) chỉ tương tác với một kháng nguyên nhất định.

Kháng thể được đánh dấu bằng enzyme (hoặc bằng chất phát huỳnh quang) để phát hiện protein đặc hiệu (thường được thẩm tích/chuyển thấm lên màng nitrocellulose sau khi chạy điện di SDS, và cố định ở đó) thông qua kỹ thuật Western blot (hoặc immunoblot) (Hình 9.11). Sau khi protein trên màng lai gắn với kháng thể thứ nhất đặc hiệu và tiếp đến là kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme (alkaline phosphatase, horse-radish peroxidase…) thì phức hợp này sẽ được liên kết với cơ chất để tạo màu. Sự hiện diện của protein ngoại lai (sản phẩm dịch mã của gen ngoại lai được chuyển vào tế bào vật chủ) sẽ được phát hiện nhờ sự xuất hiện màu của phản ứng lai.

Sự phân bố của protein đặc hiệu trong tế bào và tổ chức mô cũng có thể phát hiện bằng kỹ thuật lai in situ (in situ hybridization) với nguyên tắc tương tự Western blot. Ngoài ra, kháng thể được sử dụng để tinh sạch protein đặc hiệu bằng kết tủa miễn dịch hoặc sắc ký ái lực (affinity chromatography). Kháng thể đánh dấu được dùng để định lượng kháng nguyên trong kỹ thuật xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay) gọi tắt là ELISA (Hình 9.11).

DNA được tạo dòng trong plasmid hoặc YAC sản xuất ra các khuẩn lạc khi các nuôi cấy biến nạp được dàn mỏng trên đĩa agar chứa môi trường sinh trưởng và nuôi cấy dưới những điều kiện thích hợp. Các bacteriophage sinh tan tế bào bị chúng xâm nhiễm và sản xuất ra các plaque (vết tan) có dạng hình tròn chu vi khoảng 2-3 mm có màu sáng trên thảm vi khuẩn (bacterial lawn) của lớp agar đỉnh (trong trường hợp này người ta chuẩn bị đĩa agar có hai lớp: lớp agar đỉnh có nồng độ agar thấp để bacteriophage dễ sinh tan tế bào vi khuẩn, và lớp agar đáy có nồng độ agar cao hơn).

Các vector, như mô tả ở trên, thường chứa gen chỉ thị cho phép chọn lọc những tế bào vật chủ mang vector (thể biến nạp). Các chỉ thị này thường là gen kháng kháng sinh và các tế bào biến nạp sinh trưởng trên môi trường chứa kháng sinh tương ứng.




Hình 9.11. Kỹ thuật Western blot và ELISA dựa trên phản ứng liên kết kháng nguyên-kháng thể

Ngoài ra, các vector còn chứa các gen chỉ thị bổ sung để phân biệt các tế bào biến nạp chứa đoạn chèn của DNA ngoại lai với các tế bào chứa các vector tự tái tạo lại vòng. Ví dụ: gen lacZ mã hóa enzyme β-galactosidase.

Một dòng (clone) chứa các chuỗi DNA quan tâm đặc biệt có thể được xác định bởi lai khuẩn lạc hoặc vết tan. Một lượng nhỏ khuẩn lạc biến nạp hoặc vết tan được chuyển lên màng nitrocellulose hoặc nylon bằng cách phủ (overlay) màng này lên trên đĩa agar. DNA được biến tính và cố định trên màng bằng đun nóng (baking) hoặc chiếu tia cực tím (UV-crosslinking), và sau đó được lai trong đệm chứa probe đã đánh dấu đồng vị phóng xạ có trình tự bổ sung một phần của chuỗi được xác định. Ví dụ: Có thể một oligonucleotide tổng hợp nhân tạo, có nguồn gốc từ genomic DNA từng phần, cDNA hoặc trình tự protein hoặc sản phẩm PCR. Trong một vài trường hợp, probe có thể được thiết kế dựa trên trình tự bắt nguồn từ gen tương đồng của các loài khác và thường được lai với cường lực thấp. Các probe thừa được rửa khỏi màng để ủ với phim X-quang. Theo hướng của phim (sau khi rửa) so sánh với đĩa agar gốc, sau đó sẽ có khả năng gắn kết các khuẩn lạc thực tế với các khuẩn lạc lai dương tính tương ứng trên phim X-quang.


2. Sàng lọc thư viện gen bằng PCR

PCR (polymerase chain reaction) cũng có thể được ứng dụng để sàng lọc các thư viện genomic DNA hoặc cDNA được xây dựng trong các plasmid vector hoặc bacteriophage vector. Ưu điểm chính của sàng lọc bằng PCR so với sàng lọc dựa trên lai truyền thống là ít tốn thời gian hơn. Sàng lọc bằng PCR có thể được đảm bảo trong 3-4 giờ trong khi đó nó có thể mất một vài ngày trước khi phát hiện bằng kỹ thuật lai phân tử (molecular hybridization). Kỹ thuật sàng lọc bằng PCR thể hiện chỉ thị về kích thước của các đoạn chèn DNA được tạo dòng hơn là trình tự của đoạn chèn, tuy nhiên các primer PCR đặc trưng cho đoạn chèn DNA ngoại lai cũng có thể được sử dụng. Điều này cho phép khảo sát chính xác hơn đặc điểm của các dòng từ thư viện cDNA và genomic DNA.

▪ Nguyên tắc của PCR

PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánh dấu một bước tiến vô cùng quan trọng tương đương với việc khám phá ra các enzyme hạn chế và kỹ thuật Southern blot.

Kỹ thuật PCR dựa trên cơ sở phản ứng mở rộng primer nhờ enzyme Taq polymerase để khuếch đại in vitro các nucleic acid đặc trưng. PCR cho phép khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn DNA có chiều dài khoảng từ 200-3.000 bp. Đoạn DNA được khuếch đại (DNA đích) được nhận diện nhờ cặp primer đặc trưng (oligonucleotide) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide.

Taq polymerase là một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (có ở vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus) được dùng để tổng hợp các đoạn DNA mới trong môi trường có 4 loại deoxyribonucleotide (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết hoặc chưa biết trình tự. Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn mẫu. Sau nhiều chu kỳ, số lượng đoạn DNA nói trên được nhân lên gấp nhiều lần, nhờ vậy có thể đủ số lượng để tách ra, phân tích trình tự hoặc tạo dòng... Primer ở bên trái tác động trên sợi DNA 3’-5’ được gọi là primer thuận (forward primer-ký hiệu là F). Primer ở bên phải tác động trên sợi DNA 5’-3’ được gọi là primer ngược (reverse primer-ký hiệu là R).

Nguyên tắc của PCR được trình bày trong hình 9.12. Theo đó, từ chu kỳ thứ hai Taq polymerase bắt đầu tạo ra các đoạn DNA có chiều dài xác định. Các primer thường là một oligonucleotide tổng hợp (synthetic oligonucleotide) có khoảng 10-20 nucleotide hoặc dài hơn. Nếu biết trình tự của đoạn gen cần khuếch đại thì có thể tổng hợp nhân tạo các primer tương ứng để thực hiện PCR và tách chúng ra bằng kỹ thuật điện di. PCR thường tiến hành khoảng 25-35 chu kỳ, qua đó từ 10^-6 g DNA ban đầu có thể khuếch đại (amplification) lên tới trên 1 g (khoảng 2 kb). Mỗi chu kỳ PCR bao gồm ba giai đoạn có nhiệt độ khác nhau:

- Gây biến tính (denaturation) ở 90-95^oC. Trong giai đoạn biến tính phân tử DNA khuôn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành hai sợi đơn (single strands).

- Gắn primer (annealing) ở 40-65^oC. Trong giai đoạn này các primer gắn vào các vị trí có trình tự tương đồng ở DNA khuôn mẫu. Các liên kết ion tạo thành một đoạn nhỏ (các primer đã lắp ráp chính xác) và trên các đoạn nhỏ DNA sợi đôi đó (khuôn mẫu và primer) enzyme Taq polymerase có thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu.

- Kéo dài phân tử (extension) ở 70-72^oC. Đây là khoảng nhiệt độ tối thích cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA bắt đầu từ các vị trí có primer theo chiều 5’3’.




Hình 9.12. Sơ đồ phản ứng chuỗi DNA polymerase (PCR)

3. Sàng lọc các thư viện cDNA bằng các probe khác nhau

Sàng lọc thư viện cDNA bằng cách lai nucleic acid là phương pháp được sử dụng phổ biến và đáng tin cậy nhất để tìm kiếm các dòng quan tâm. Sàng lọc bằng phương pháp lai nucleic acid cho phép phân tích đồng thời nhiều dòng và nhanh, không đòi hỏi các dòng cDNA phải hoàn chỉnh và sản phẩm được tổng hợp trong tế bào vật chủ phải có hoạt tính sinh học hoặc kháng nguyên. Hơn nữa, cơ sở lý thuyết của kỹ thuật lai nucleic acid đã được hiểu biết đầy đủ. Điều này cho phép phát triển một số lượng lớn các kỹ thuật khác nhau có thể điều chỉnh các probe của nucleic acid có các chiều dài và đặc điểm khác nhau.

- Các probe tương đồng. Các probe tương đồng chứa ít nhất một phần của chuỗi nucleic acid chính xác của dòng cDNA quan tâm. Chúng được dùng trong nhiều trường hợp khác nhau, ví dụ: khi một dòng bộ phận của cDNA hiện có được sử dụng để phân lập một dòng hoàn chỉnh từ thư viện cDNA. Thông thường, đoạn bắt nguồn từ một đầu hoặc đầu kia của dòng hiện có được phân lập, đánh dấu phóng xạ in vitro và dùng để thăm dò thư viện. Lai với các probe tương đồng thường được tiến hành dưới các điều kiện nghiêm ngặt.

- Các probe tương đồng từng phần. Các probe tương đồng từng phần được dùng để phát hiện các dòng cDNA có quan hệ họ hàng, nhưng không giống hệt nhau hoàn toàn, với các trình tự của probe.

- Các probe oligonucleotide nhân tạo. Các probe oligonucleotide nhân tạo là các vùng dNTP của trình tự xác định được tổng hợp in vitro. Trình tự của các probe này được suy luận, bằng cách dùng mã di truyền, từ các vùng ngắn của chuỗi amino acid đã biết của protein quan tâm. Do sự thoái biến của mã di truyền³, chuỗi amino acid đề xuất có thể không được đặc trưng chính xác bởi các oligonucleotide đơn được dự đoán cho trình tự. Mặc dù, trong rất nhiều trường hợp, trình tự các amino acid giống nhau có thể được đặc trưng bởi nhiều oligonucleotide khác nhau.


4. Phân tích genomic DNA bằng phương pháp lai Southern

Việc phát hiện và xác định các chuỗi nucleic acid đặc trưng là công việc thường xuyên trong nghiên cứu sinh học phân tử. Nguyên tắc của kỹ thuật này là dựa vào sự lai phân tử, dưới các điều kiện thích hợp hai chuỗi nucleic acid đơn tạo thành một phân tử lai. Phản ứng lai phụ thuộc rất nhiều vào mức độ tương đồng của hai chuỗi nucleotide. Việc tạo thành phân tử sợi đôi như thế xảy ra chủ yếu thông qua liên kết hydrogen giữa các base guanosine với cytosine, và adenosine với thymidine. Thành phần và sự phân bố của các base không giống rõ rệt với các phân tử nucleic acid cho kết quả các tính chất lai khác nhau, vì thế liên kết hydrogen (hoặc lai phân tử giữa các base tương đồng) khi được ghép cặp thích hợp đã cung cấp một công cụ có giá trị để xác định các chuỗi liên quan hoặc đồng nhất với chuỗi nucleic acid quan tâm (probe).

Trong số các kỹ thuật khác nhau sử dụng lai phân tử để phân tích nucleic acid, thì kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất là lai mẫu dò nucleic acid được đánh dấu với nucleic acid đích được cố định trên một vật đỡ rắn, đặc trưng là màng nitrocellulose hoặc nylon.

Trình tự của kỹ thuật lai Southern blot bao gồm các bước sau: phân tách các đoạn cắt hạn chế của DNA hệ gen bằng điện di agarose gel, chuyển DNA từ agarose gel lên màng lai, lai các mẫu dò được đánh dấu đồng vị phóng xạ với các nucleic acid được cố định trên màng lai (Hình 9.13).

Các thí nghiệm lai trên màng thường được tiến hành bằng cách đánh dấu probe bằng ³²P (mặc dù các đồng vị phóng xạ khác như ³⁵S cũng có thể được sử dụng). Phản ứng lai của Southern đòi hỏi hoạt tính đặc hiệu của probe tối thiểu phải là 10⁹ dpm/μg, mặc dù hoạt tính 10⁸ dpm/μg có thể được xem như là chấp nhận được trong các ứng dụng cần cường lực thấp. Các phương pháp không dùng đồng vị phóng xạ (ví dụ: digoxigenin-dUTP) ngày càng được sử dụng phổ biến hơn mặc dù độ nhạy của chúng là không lớn. Nhưng các kỹ thuật không dùng đồng vị phóng xạ an toàn hơn cho nghiên cứu viên, tạo ra các probe có thể được bảo quản trong thời gian dài trước khi dùng và kết quả phát hiện các tín hiệu lai nhanh hơn.

Công nghệ DNA tái tổ hợp hiện nay có rất nhiều ứng dụng trong đời sống. Các ứng dụng này bao gồm sản xuất dược phẩm và các loại hóa chất khác, các vi khuẩn đặc biệt, các cây trồng nông nghiệp quan trọng, và các vật nuôi đã được biến đổi di truyền... Kỹ thuật này cũng được sử dụng rộng rãi trong các xét nghiệm y khoa và (trong một vài trường hợp) đang được dùng để kiểm tra các khiếm khuyết di truyền ở người. Hàng trăm công ty hiện nay đang đặc biệt phát triển các sản phẩm thông qua biến đổi di truyền các cơ thể sống. Dưới đây là các ứng dụng chính của công nghệ DNA tái tổ hợp.

Sản phẩm thương mại đầu tiên được phát triển bằng công nghệ DNA tái tổ hợp là các dược phẩm dùng trong điều trị các bệnh và các rối loạn ở người. Năm 1979, Tổ hợp Eli Lilly bắt đầu sản xuất thương mại insulin người bằng công nghệ DNA tái tổ hợp. Trước thời điểm này, tất cả insulin dùng trong điều trị bệnh tiểu đường được tách chiết từ tụy của các vật nuôi cho thịt. Mặc dù nguồn insulin này có tác dụng tốt cho nhiều người mắc bệnh tiểu đường, nhưng nó vẫn không phải là insulin người, và một số người đã trải qua các phản ứng phụ với protein ngoại lai. Gen insulin người sau đó đã được chèn vào plasmid và chuyển vào vi khuẩn để sản xuất insulin người. Các dược phẩm được sản xuất thông qua công nghệ DNA tái tổ hợp bao gồm: hormone sinh trưởng người (cho trẻ em mắc bệnh còi), nhân tố tạo tơ huyết (chữa bệnh khó đông máu), hoạt tố plasminogen mô (dùng để hòa tan các huyết khối trong bệnh nhân bị nhồi máu cơ tim), interferon, interleukin, DNA vaccine…

Các vi khuẩn có vai trò quan trọng trong các quá trình công nghiệp, bao gồm sản xuất ethanol từ các nguyên liệu thực vật, lọc khoáng từ quặng, xử lý nước thải và các loại chất thải khác. Các vi khuẩn đang sử dụng trong các quá trình này được biến đổi di truyền bằng công nghệ DNA tái tổ hợp sao cho chúng có thể hoạt động hiệu quả hơn. Các chủng vi khuẩn mới hữu ích thu được từ kỹ thuật hiện đại này đang được phát triển để phân hủy các hóa chất độc và các chất gây ô nhiễm, tăng cường thu hồi dầu, tăng nitrogen cho cây trồng, và ức chế sinh trưởng của các vi khuẩn và vi nấm gây bệnh.

Công nghệ DNA tái tổ hợp cũng đã có một ảnh hưởng quan trọng đến sản xuất nông nghiệp, nơi mà hiện nay nó được dùng để tạo ra các cây trồng và vật nuôi mang các đặc điểm có giá trị. Trong nhiều năm, các nhà bệnh học thực vật đã thừa nhận rằng thực vật bị nhiễm bệnh virus thể nhẹ sau đó sẽ kháng lại sự nhiễm trùng các chủng mang độc tính mạnh. Vì vậy, các nhà di truyền học đã tạo ra tính kháng virus trong cây trồng bằng cách chuyển các gen vỏ protein của virus vào tế bào thực vật. Cây bí (squash) biến đổi di truyền có tên là Freedom II, mang các gen của virus 2 gây bệnh khảm ở dưa hấu (watermelon mosaic virus 2) và virus gây bệnh khảm màu vàng ở cây zucchini (zucchini yellow mosaic virus) để chống sự nhiễm trùng virus.

Một hướng khác được biến đổi di truyền đó là tính kháng sâu (pest) ở thực vật đã làm giảm sự phụ thuộc vào các thuốc trừ sâu hóa học. Độc tố protein từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis đã giết một cách chọn lọc các ấu trùng của các sâu bọ côn trùng nhất định nhưng lại không gây độc cho sự sống của các động vật hoang dã, người và các loài côn trùng khác. Gen độc tố được phân lập từ vi khuẩn, liên kết với promoter hoạt động sau đó được chuyển vào trong ngô, cà chua, khoai tây và bông. Gen này đã sản xuất độc tố đối với côn trùng trong cây, và sâu bướm khi ăn cây đã bị chết.

Công nghệ DNA tái tổ hợp cũng đã cho phép phát triển tính kháng chất diệt cỏ ở thực vật. Một vấn đề quan trọng trong nông nghiệp là điều khiển các cỏ dại cạnh tranh nước, ánh sáng và chất dinh dưỡng với cây trồng. Mặc dù chất diệt cỏ có tác dụng giết cỏ dại, nhưng chúng cũng có thể gây nguy hiểm cho cây trồng. Các gen cung cấp tính kháng cho nhiều loại chất cỏ dại đã được chuyển vào cà chua, đậu tương, bông, cây cải dầu và các cây trồng thương mại quan trọng khác. Khi đồng ruộng có canh tác các cây trồng này được phun thuốc diệt cỏ, thì cỏ dại bị giết nhưng các cây trồng biến đổi di truyền lại không bị ảnh hưởng. Năm 1999, đã có hơn 21 triệu ha cây đậu tương biến đổi di truyền và 11 triệu ha cây ngô chuyển gen được trồng trên thế giới.

Công nghệ DNA tái tổ hợp cũng được ứng dụng cho các vật nuôi. Ví dụ: gen sản xuất hormone sinh trưởng được phân lập từ gia súc và được tạo dòng trong E. coli, các vi khuẩn này sản xuất một lượng lớn hormone sinh trưởng của bò, yếu tố liên quan đến tăng sản xuất sữa. Các động vật chuyển gen được phát triển để mang gen mã hóa cho các sản phẩm dược liệu. Ví dụ: một gen người mã hóa cho nhân tố VIII (hình thành tơ huyết) được liên kết với vùng điều hòa của gen sản xuất β-lactoglobulin ở cừu, một protein tạo sữa. Gen dung hợp được tiêm vào phôi cừu, tạo ra một con cừu chuyển gen có khả năng sản xuất trong sữa của nó nhân tố đông máu của người. Một phương thức tương tự được dùng để chuyển gen α₁-antitrysin, một protein dùng để điều trị bệnh nhân khí thũng di truyền (hereditary emphysema), vào trong cừu. Cừu cái mang gen này sản xuất rất nhiều α ₁-antitrysin khoảng 15g trong 1 lít sữa của chúng.


4. Thuốc oligonucleotide

Một ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp trong thời gian gần đây đó là phát triển các thuốc oligonucleotide có trình tự phân tử DNA hoặc RNA nhân tạo ngắn có thể được dùng để điều trị bệnh. Các antisense oligonucleotide bổ sung cho các RNA không mong muốn, như là RNA của virus. Khi được bổ sung vào tế bào, thì các antisense DNA này liên kết với mRNA của virus và ức chế sự dịch mã của chúng.

Các DNA oligonucleotide sợi đơn liên kết chặt chẽ với các trình tự DNA khác, tạo thành một phân tử triplex DNA. Sự tạo thành triplex DNA cản trở liên kết của RNA polymerase và các protein khác cần cho sự phiên mã. Các oligonucleotide khác là các ribozyme, các phân tử RNA mà chức năng như là các enzyme. Những phức hợp này liên kết với các phân tử mRNA đặc hiệu và cắt chúng thành từng đoạn, phá hủy khả năng mã hóa protein của chúng. Một số thuốc oligonucleotide đã sẵn sàng để thử nghiệm trong điều trị bệnh AIDS và ung thư.


5. Liệu pháp gen

Đối với loại bệnh di truyền, bệnh do đột biến gen người ta phải cần đến sự can thiệp của liệu pháp gen, một hướng chữa bệnh gắn liền với các kỹ thuật tiên tiến trong lĩnh vực công nghệ sinh học hiện đại như các vi thao tác gen, sửa đổi thay thế gen...

Liệu pháp gen (gene therapy) thực chất là phương pháp chữa bệnh bằng gen. Có nhiều khái niệm khác nhau về liệu pháp gen, nhưng cách hiểu chung nhất là tập hợp các biện pháp để sử dụng các gen cần thiết (còn gọi là gen trị liệu) nhằm mục đích chữa bệnh cho con người.

Trong đó, gen trị liệu có thể là:

- Các gen hoạt động bình thường (gen lành) có thể đưa vào tế bào để thay thế gen hỏng, gen mất chức năng, khôi phục hoạt động bình thường của tế bào và sự sống của cơ thể.

- Là những gen có khả năng mã hóa một protein đặc hiệu, khi đưa vào tế bào sống có thể tạo nên các loại protein đặc hiệu. Các loại protein đặc hiệu có thể ức chế hoạt động của một gen khác trong tế bào, kìm hãm khả năng phân chia của tế bào hoặc gây chết các tế bào bị bệnh.

- Những gen khi đưa vào tế bào hoạt động đồng thời với các gen bệnh (gen bị đột biến trong tế bào) làm hạn chế tác động của gen bệnh hoặc hỗ trợ, bù đắp cho các gen bị hỏng.

- Gen trị liệu còn là các gen bất hoạt được đưa vào tế bào thay thế cho một gen lành nào đó, nhằm hạn chế sản phẩm không cần thiết của gen lành hoặc tạo ra cho tế bào một trạng thái mới, có tác dụng chống lại bệnh tật.

- Gen trị liệu có thể là những đoạn oligonucleotide có tác dụng kìm hãm hoạt động của gen bị hỏng, bị đột biến trong tế bào.

6. Chẩn đoán bệnh để can thiệp sớm

Bằng kỹ thuật chọc ối, kết hợp đồng thời phân tích máu bố mẹ bằng enzyme hạn chế, người ta có thể chẩn đoán sớm trước khi sinh (vì enzyme hạn chế có khả năng phân biệt được gen đột biến với gen bình thường). Các đoạn DNA cắt ra, được phân tách qua phương pháp điện di, đem lai với các mẫu dò DNA hoặc RNA đã đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ ³²P hoặc huỳnh quang. Ảnh phóng xạ tự ghi hoặc tín hiệu huỳnh quang cho ta thấy các đoạn DNA được lai với các mẫu dò. Các đoạn này được tách ra để nghiên cứu và xác định đột biến hay bình thường bằng enzyme hạn chế, vì một số đột biến di truyền có ảnh hưởng đến các vị trí dành cho enzyme hạn chế.

Ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong lĩnh vực này có nhiều thuận lợi hơn các phương pháp kinh điển. Thứ nhất, có thể rút ngắn được thời gian nhờ ứng dụng kỹ thuật PCR, chẳng hạn chẩn đoán bệnh HIV-1, dùng phương pháp PCR chỉ mất một ngày so với 3-4 tuần nuôi cấy của phương pháp truyền thống. Thứ hai, đối với các tác nhân gây bệnh khó nuôi cấy hay không thể nuôi cấy thì kỹ thuật sinh học phân tử là giải pháp duy nhất, chẳng hạn Chlamydia, Brucella, viêm gan B,... Thứ ba, việc tạo dòng một gen dùng làm probe đơn giản hơn việc sản xuất kháng thể đặc hiệu, hơn nữa với một probe người ta có thể phát hiện tất cả các kiểu huyết thanh (serotype) của tác nhân gây bệnh, điều mà chỉ một kháng thể không thể làm được. Cuối cùng, nếu trước kia phải cần đến nhiều kỹ thuật (quan sát dưới kính hiển vi, nuôi cấy trên một loạt môi trường, miễn dịch học...) thì hướng chẩn đoán bằng sinh học phân tử chỉ cần một kỹ thuật (lai phân tử hoặc PCR).

Đối với tác nhân là virus, các kỹ thuật lai phân tử và PCR đã cho phép chẩn đoán nhiều nhóm như papillomavirus, HBV, HIV. Đặc biệt phương pháp lai tại chỗ còn cho phép xác định trực tiếp virus trên lát cắt sinh thiết.

Đối với các tác nhân vi khuẩn, đã có nhiều bộ kit chẩn đoán sinh học phân tử được thương mại hóa như: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium pneumoniae, Salmonella, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae...

Đối với các tác nhân ký sinh trùng, người ta cũng đã thành công trong chẩn đoán Plasmodium, Schistosoma, Trypanosoma, Toxoplasma, Leishmania… bằng lai phân tử. Phương pháp PCR còn cho phép phát hiện tác nhân ngay trong vật trung gian truyền bệnh.

Sử dụng các trình tự DNA để nhận dạng một người, được gọi là DNA fingerprinting, là một công cụ rất mạnh để khảo sát tội phạm và các ứng dụng pháp lý khác.

Trong một ứng dụng đặc trưng, DNA fingerprinting có thể được dùng để xác nhận một sự nghi ngờ hiện diện ở hiện trường gây án. Một mẫu DNA của máu, tóc, tinh dịch hoặc mô của cơ thể được thu thập từ hiện trường. Nếu mẫu là rất nhỏ, phương pháp PCR có thể được dùng để khuếch đại cho đủ DNA, sẵn sàng cho việc kiểm tra. Các mẫu DNA bổ sung được thu thập từ một hoặc nhiều nghi can khác.

Mỗi một mẫu được cắt với một hoặc nhiều RE, và kết quả các đoạn DNA được phân tách bằng điện di. Các đoạn trên gel được biến tính và chuyển lên màng nitrocellulose bằng thẩm tích Southern (blot). Một hoặc nhiều probe (được đánh dấu phóng xạ) sau đó được lai với màng nitrocellulose và được phát hiện bằng phóng xạ tự ghi. Kiểu của băng được tạo ra bởi DNA từ mẫu được thu thập ở hiện trường sau đó được so sánh với các kiểu được tạo ra bởi DNA từ những nghi can.

Các probe được dùng trong DNA fingerprinting phát hiện các vùng thay đổi cao của genome, vì thế cơ hội DNA từ hai người sản xuất chính xác cùng một kiểu băng là rất thấp. Khi một số probe được dùng trong phân tích, thì xác suất mà hai người có cùng một tập hợp các kiểu là gần như không có (trừ khi họ là cặp sinh đôi giống hệt nhau).

Mẫu khớp nhau từ hiện trường và nghi can có thể cung cấp bằng chúng rằng nghi can có mặt tại hiện trường vụ án.

Probe được dùng phổ biến nhất trong DNA fingerprinting bổ sung cho các trình tự lặp lại ngắn được tìm thấy rất nhiều trong genome người. Con người khác nhau rất nhiều về số lượng bản sao của các trình tự lặp lại này; vì vậy, các đa hình này được gọi là số lượng biến thiên của các đoạn lặp lại tuần tự (VNTRs).

DNA fingerprinting cũng được sử dụng để cung cấp thông tin về mối quan hệ huyết thống và các nguồn cơ thể sống khác. Ví dụ: DNA fingerprinting được dùng để xác định một số mẫu vi khuẩn gây bệnh than (anthrax) gửi bằng bưu điện đến những người khác trong năm 2001 tất cả là từ một nguồn mẫu.

Một đóng góp có ý nghĩa của công nghệ DNA tái tổ hợp đó là cung cấp một lượng lớn các marker (chỉ thị) di truyền được dùng trong lập bản đồ gen. Một nhóm trong số các marker được dùng trong lập bản đồ gen đó là restriction fragment length polymorphism (RFLP). RFLP là những biến đổi đa hình trong các kiểu của các đoạn DNA được tạo ra khi phân tử DNA được cắt cùng một enzyme hạn chế. Nếu DNA từ hai người được cắt bởi cùng một enzyme và kiểu của các đoạn DNA khác nhau được tạo ra, thì hai người này phải có sự khác nhau về các trình tự DNA của họ. Những sự khác nhau này được di truyền và có thể được dùng trong lập bản đồ, tương tự với phương thức mà trong đó sự khác nhau về allele được dùng để lập bản đồ các gen thông thường.