Các tác giả Chương 1 Các đại phân tử sinh học I. Nucleic acid

Việc tăng mức độ biểu hiện của protein RecA cần thiết cho vai trò trực tiếp của nó trong các phương thức sửa chữa-tái tổ hợp. Về sự cảm ứng, nồng độ của RecA được tăng lên 50 lần so với nồng độ ban đầu của nó khoảng 1.200 phân tử/tế bào. Nồng độ cao ở các tế bào được cảm ứng có nghĩa là có đủ RecA để đảm bảo rằng tất cả protein LexA bị phân giải.

Ngoài các hệ thống sửa sai, tế bào còn có hệ thống bảo vệ DNA. Các vi khuẩn có hệ thống miễn nhiễm hiệu quả DNA lạ, đó là: hệ thống cắt hạn chế-biến đổi (restriction-modification system) hiện diện trong nhiều loài vi khuẩn, trong đó DNA được biến đổi bởi các enzyme đặc hiệu.

Sự biến đổi xảy ra nhằm mục đích bảo vệ DNA chống lại sự phân hủy enzyme (cắt hạn chế) bởi các endonuclease của chính chúng. Sự biến đổi bao gồm một kiểu đặc trưng của phản ứng methyl hóa các gốc nucleotide trong DNA. Bằng cách dùng S-adenosylmethionine như là một chất cho, các enzyme methyl hóa (methylase) sẽ hoạt động trên DNA sợi đôi (dsDNA). Các vị trí mà ở đó có sự biến đổi cũng được nhận biết bởi các enzyme hạn chế (restriction enzyme, RE) tương ứng, tuy nhiên các enzyme hạn chế không thể cắt DNA trong các vị trí đã được biến đổi này ở một hoặc cả hai sợi DNA.

Các vi sinh vật prokaryote lẫn eukaryote đều có các enzyme methyl hóa gắn nhóm CH₃ ở những điểm nhất định trên phân tử DNA. Các enzyme này có tính đặc hiệu cao chuyên hóa cho từng dòng vi khuẩn, vì thế DNA của mỗi dòng vi khuẩn chỉ được methyl hóa ở những vị trí đặc biệt nhất định. Nhờ đó, mỗi vi khuẩn dễ dàng phân biệt DNA của bản thân chúng với DNA ngoại lai (foreign DNA) (ví dụ: DNA của bacteriophage) xâm nhập vào trong tế bào. Các enzyme cắt hạn chế là một loại endonuclease của mỗi dòng vi khuẩn (xem chương 9), không cắt DNA của chúng vì đã được methyl hóa ở những điểm cần thiết mà chỉ cắt DNA ngoại lai (của bacteriophage) do chúng không được methyl hóa ở những vị trí nhất định.

Các cơ chế chủ yếu biến đổi của DNA của nó một cách đặc hiệu và cắt hạn chế (restriction) các phân tử DNA không được đánh dấu. Hệ thống R-M ngăn chặn DNA ngoại lai không có hoạt động chức năng nhưng có thể thực hiện tái tổ hợp.

Hệ thống R-M có hai tính chất căn bản:

- Hoạt tính restriction (cắt hạn chế) đặc hiệu chống sự xâm nhập của DNA ngoại lai.

- Hoạt tính bảo vệ DNA của bản thân nó.

Hệ thống R-M lần đầu tiên được phát hiện khi nghiên cứu hiện tượng nhiễm bacteriophage vào E. coli. Sự biến đổi thường là methyl hóa nhóm 6-NH₂ của adenine ở những trình tự nucleotide đặc hiệu trong hệ thống kiểu II, C5 của cytosine được methyl hóa. Cắt hạn chế được thực hiện do các hệ thống endonuclease. Chúng nhận biết các điểm đặc hiệu ít nhất ở một sợi DNA không bị biến đổi. Endonuclease cắt đứt sợi ở nhiều điểm nhận biết và sau đó các đoạn ngắn được cắt bằng nucleotide khác.

Phần lớn các DNA bị biến đổi có các đặc tính di truyền không ổn định. Sự methyl hóa thường mất qua tái bản trong tế bào chủ.

Các nghiên cứu cho thấy ở chủng E. coli B có 3 gen liên kết chặt với nhau mã hóa cho 3 sản phẩm khuếch tán: các polypeptide phục vụ cho sự cắt hạn chế, cho sự biến đổi và tạo sự đặc hiệu của điểm nhận biết.

DNA sợi kép nhạy cảm hơn với sự biến đổi và cắt hạn chế. Các bacteriophage sợi đơn như M13 và  X 174 ít bị tác động hơn. Sự biến đổi của một sợi DNA đủ để miễn nhiễm DNA lạ. Do vậy, DNA tái bản bán bảo tồn được bảo vệ bởi methyl hóa sợi khuôn.

Methylase là enzyme có hoạt tính xúc tác gắn một nhóm methyl vào một phân tử, ví dụ: DNA methyltransferase có chức năng methyl hóa các gốc C trong DNA.

Enzyme methylase tạo ra một cặp adenine methyl hóa (hoặc cytosine) có vị trí đối xứng chéo nhau. Các methylase có liên quan chặt chẽ với các kiểu cắt hạn chế.

- Kiểu I. Các RE có thể tiến hành cả hai sự biến đổi và cắt hạn chế. Một RE kiểu I bao gồm ba tiểu đơn vị khác nhau (R, M và S) chịu trách nhiệm tương ứng cho việc cắt hạn chế, biến đổi và nhận biết trình tự. Ví dụ: EcoB và EcoK (từ E. coli chủng B và K), các trình tự nhận biết của hai enzyme này là TGA(N)₈TGCT đối với EcoB và AAC(N)­₆GTGC đối với EcoK (trong đó N là một trong bốn loại nucleotide). Nếu vị trí nhận biết không được methyl hóa trong một sợi, thì enzyme RE sẽ methyl hóa sợi đó, nhưng nếu cả hai sợi đều không được methyl hóa thì enzyme RE sẽ cắt DNA (cần có ATP). Phản ứng cắt xuất hiện ở một vị trí không đặc hiệu >1000 bp tính từ trình tự nhận biết; rõ ràng là enzyme duy trì liên kết ở vị trí nhận biết của nó, và DNA được di chuyển qua một vị trí thứ hai trên enzyme hướng tới một vị trí cắt hạn chế.

Sự methyl hóa A và C thực hiện rộng rãi ở tất cả các loại DNA. Ở prokaryote (kể các bacteriophage và plasmid), vai trò thể hiện rõ là phân hủy DNA ngoại lai. Vai trò phụ là phân biệt DNA bố mẹ với sợi con mới được tổng hợp trong phục hồi các chỗ bắt cặp sai. Ở prokaryote, các sinh vật không có hệ thống cắt hạn chế, vai trò chủ yếu của methyl hóa có lẽ ở sự điều hòa biểu hiện của gen.

Bên cạnh các methylase của hệ thống R-M, còn có các methyltransferase khác ở E. coli. Các nucleotide được methyl hóa không gắn trực tiếp vào DNA. Các methylase chuyển nhóm methyl từ S-adenosine methionine sang adenine và cytosine ở những điểm đặc hiệu trên DNA.


3. Sự methyl hóa DNA của eukaryote

Sự methyl DNA của eukaryote có nhiều điểm khác với ở prokaryote:

- Base bị biến đổi chủ yếu ở eukaryote là 5-methylcytosine. Ở động vật có vú, chỉ có 5-methylcytosine là base bị biến đổi, trong đó 90% là trình tự đối xứng CpG.

- Do chưa hiểu biết rõ hệ thống R-M ở eukaryote nên người ta cho rằng có lẽ methyl hóa không góp phần bảo vệ chống sự xâm nhập của DNA ngoại lai.

Sự methyl hóa của DNA động vật có vú góp phần vào sự điều hòa biểu hiện của gen và biệt hóa tế bào. Các nghiên cứu cho thấy có sự tương quan thuận giữa methyl hóa thấp (hyphomethylation) với hoạt tính của gen và ngược lại giữa sự methyl hóa mạnh với bất hoạt của gen. Sự vắng mặt của các nhóm methyl trên DNA của ruồi giấm chứng tỏ rằng sinh vật đã biệt hóa cao có thể hoạt động không cần cơ chế methyl hóa.

Sự methyl hóa ở động vật có vú có thể đóng vai trò:

- Thay đổi trạng thái của DNA và ức chế ái lực của repressor với operator.

- Sự methyl hóa được truyền đạt theo dòng tế bào soma.

- Methyl hóa có thể tạo sự khác nhau giữa các mô.

- 5-azacytidine, chất đồng đẳng với cytidine, tác động làm tế bào nguyên bào sợi (fibroblast) biệt hóa thành tế bào cơ, có lẽ do cơ chế ức chế methyl hóa DNA và như vậy hoạt hóa gen tương ứng.

Như chúng ta đã biết ba quá trình thiết yếu cho sự tồn tại của tế bào, đó là: tái bản, phiên mã và dịch mã. Tuy nhiên, tế bào không thể tồn tại độc lập với môi trường chung quanh. Như vậy, sẽ nảy sinh một vấn đề quan trọng: tế bào sẽ điều chỉnh hoạt động của mình như thế nào cho phù hợp với các biến đổi của môi trường bên ngoài để có thể tồn tại thích ứng? Chương này sẽ đề cập đến các phương thức điều chỉnh đó, tức là các cơ chế điều hòa sự biểu hiện của gen ở các sinh vật prokaryote và eukaryote.

Sự biểu hiện của các gen chịu sự kiểm soát của các cơ chế điều hòa. Các cơ chế này giữ vai trò rất quan trọng cho các hoạt động sống, đáp lại những biến đổi của môi trường bên trong và bên ngoài cơ thể. Biểu hiện gen của các tế bào prokaryote và eukaryote cũng có sự khác nhau đáng kể. Việc điều hòa được thực hiện ở nhiều mức độ khác nhau và liên quan đến từng giai đoạn phát triển. Theo quan niệm về operon, các gen điều hòa (regulatory gene) giữ vai trò quan trọng trong việc đóng và mở các gen cấu trúc (structural gene) để có thể biểu hiện tổng hợp protein đúng lúc, đúng nơi theo nhu cầu cụ thể của tế bào.

Trong mọi tế bào, tất cả các gen đều không hoạt động đồng thời. Ví dụ: tế bào E. coli có khoảng 10⁷ phân tử protein gồm 3.000 loại khác nhau. Nhiều loại protein có đến 500.000 phân tử, tuy nhiên một số loại khác chỉ khoảng 10 phân tử. Như vậy, không phải loại protein nào cũng được tổng hợp với số lượng lớn như nhau và tế bào phải có những cơ chất để tổng hợp protein một cách tiết kiệm và hợp lý nhất.

Một số gen hoạt động thường xuyên cung cấp sản phẩm liên tục, một số khác chỉ biểu hiện ở những giai đoạn nhất định trong chu trình sống và có thể chỉ hoạt động trong điều kiện môi trường không bình thường. Một số protein cần được tổng hợp với số lượng lớn, một số khác chỉ cần có một phân tử. Do vậy, hoạt tính của gen được điều hòa bởi nhiều cơ chế khác nhau để có hiệu quả tốt nhất trong việc sử dụng nguồn năng lượng của tế bào.

I. Các hiện tượng điều hòa

Để duy trì nội cân bằng (homeostasis) và sự phát triển của cơ thể, các sinh vật đã có các cơ chế điều hòa khác nhau. Các kiểu điều hòa đều bắt nguồn từ sự biểu hiện của các gen.

Một số amip (ameba) biểu hiện sự thay đổi hình thái và sinh lý đặc biệt để đáp lại các điều kiện môi trường khác nhau. Khi các amip được cho vào nước, chúng chuyển từ dạng amip sang dạng có lông để bơi. Khi môi trường thiếu dinh dưỡng chúng có thể chuyển thành các dạng tương tự như biểu bì.

Vi khuẩn trong môi trường dinh dưỡng tối thiểu có khả năng tổng hợp amino acid. Nhưng khi bổ sung amino acid vào môi trường nuôi, vi khuẩn sẽ ngừng tổng hợp amino acid. Lúc nguồn amino acid từ ngoài bổ sung vào đã hết, tế bào vi khuẩn lại tự tổng hợp lại amino acid cho bản thân.

Các biến đổi nêu trên là thuận nghịch, chứng tỏ sự thay đổi chức năng ở đây không phải do biến dị di truyền. Các hiện tượng trên còn cho thấy việc xuất hiện hay biến mất các cấu trúc mới không làm ảnh hưởng đến tiềm năng di truyền sẵn có. Có thể cho rằng, có trường hợp một số gen hoạt động, nhưng cũng có trường hợp một số gen ngừng biểu hiện. Các hiện tượng được đề cập trên đều do cơ chế điều hòa thích nghi (adaptive regulation) chi phối.

Khi bacteriophage xâm nhiễm vi khuẩn, DNA của nó lúc đầu sẽ tái bản, sau đó các protein khác nhau mới được tổng hợp nên để tạo thành vỏ. Như vậy, có các gen “sớm” tạo ra enzyme tái bản DNA và các gen “muộn” xác định các thành phần vỏ protein. Điều đó chứng tỏ có cơ chế điều hòa chức năng của gen diễn ra theo một trình tự nghiêm ngặt. Đây là kiểu điều hòa nối tiếp (sequential regulation). Hoạt động nối tiếp của các gen còn thể hiện rõ trong quá trình phát triển cá thể của các sinh vật eukaryote đa bào.

Nhiều sinh vật bậc cao như con người chứa nhiều tỷ tế bào bắt nguồn từ một hợp tử do phân chia nguyên nhiễm. Từ một hợp tử ban đầu đến khi trưởng thành, cơ thể người có khoảng 200 loại tế bào khác nhau. Mỗi loại tế bào chỉ biểu hiện một phần thông tin của mình. Quá trình chuyên môn hóa chức năng của tế bào được gọi là sự biệt hóa hay phân hóa (differentiation).

Tuy có sự biệt hóa, nhưng tế bào vẫn giữ nguyên vẹn khả năng di truyền của mình. Một ví dụ rất rõ là nuôi cấy mô tế bào thực vật (plant tisue and cell culture): người ta có thể nuôi cấy một phần mô phân sinh trong môi trường dinh dưỡng tổng hợp cho đến khi chúng phát triển thành cây in vitro hoàn chỉnh (plantlet), các cây này sau đó được đưa ra trồng trong điều kiện tự nhiên và đã ra hoa kết quả.

4. Khái quát về điều hòa ở prokaryote và eukaryote

Có sự khác nhau đáng kể giữa prokaryote và eukaryote trong điều hòa biểu hiện của gen. Các tế bào eukaryote có cấu tạo phức tạp hơn nhiều nên cơ chế điều hòa cũng phức tạp hơn prokaryote.

Ở prokaryote, mục đích của sự điều hòa biểu hiện gen là nhằm điều chỉnh hệ enzyme cho phù hợp với các tác nhân dinh dưỡng và lý hóa của môi trường, đảm bảo được hai yêu cầu chính của tế bào là sinh trưởng và sinh sản. Sự điều hòa ở đây rất linh động và có tính thuận nghịch. Ở eukaryote, do tế bào không tiếp xúc trực tiếp với môi trường, nên sự điều hòa ở đây không còn nhằm mục đích đối phó với các biến động ở ngoại bào. Sự điều hòa ở eukaryote hướng đến việc chuyên biệt hóa từng loại tế bào vào từng cấu trúc và chức năng riêng và vì thế không mang tính thuận nghịch.

Ba thành phần chính của sự điều hòa biểu hiện gen là: 1) Tín hiệu gây ra đáp ứng làm thay đổi biểu hiện gen; 2) Giai đoạn được thực hiện sự điều hòa trong quá trình từ tái bản đến dịch mã; và 3) Cơ chế phân tử của sự điều hòa biểu hiện gen.

4.1. Sự biểu hiện của gen ở prokaryote

Bộ máy di truyền của sinh vật prokaryote là một DNA mạch vòng chứa một số lượng gen giới hạn được phiên mã ở trạng thái tiếp xúc trực tiếp với tế bào chất (Hình 8.1).

Chu trình tế bào ngắn và không có sự biệt hóa tế bào. Vì thế, hoạt động của các gen được điều hòa do các nhu cầu của tế bào khi cần thiết. Tác động của các nhân tố môi trường làm những gen tương ứng được mở để phiên mã, dịch mã tổng hợp protein hay có hiệu quả ngược làm dừng lại.



Hình 8.1. Sự biểu hiện gen ở prokaryote

4.2. Sự biểu hiện của gen ở eukaryote

Khác với prokaryote, nhiễm sắc thể của eukaryote có cấu trúc phức tạp. Ngay trên cấu trúc nhiễm sắc thể có sự tham gia của các protein histone có vai trò điều hòa biểu hiện của gen. Sự điều hòa biểu hiện gen ở eukaryote phải qua nhiều mức điều hòa phức tạp hơn so với prokaryote và qua nhiều giai đoạn như: nhiễm sắc thể tháo xoắn, phiên mã, biến đổi hậu phiên mã, mRNA rời nhân ra tế bào chất, dịch mã và biến đổi hậu dịch mã (Hình 8.2).

Ngoài ra, đa số eukaryote có cơ thể đa bào và mỗi tế bào có biểu hiện sống không phải tự do, mà chịu sự biệt hóa theo các chức năng chuyên biệt trong mối quan hệ hài hòa với cơ thể.

Các vi khuẩn thường phản ứng trực tiếp với môi trường và biểu hiện gen thuận nghịch, như có đường lactose thì mở operon để phân hủy, khi hết đường thì operon đóng lại. Trong khi đó, các tế bào eukaryote có những con đường biệt hóa khác nhau và sự chuyên hóa là ổn định thường xuyên trong đời sống cá thể. Ngoài sự biệt hóa tế bào, các cơ thể eukaryote đa bào còn trải qua quá trình phát triển cá thể với nhiều giai đoạn phức tạp nối tiếp nhau, trong đó có những gen chỉ biểu hiện ở phôi và sau đó thì dừng hẳn.

Tất cả những điểm nêu trên cho thấy sự điều hòa biểu hiện của gen eukaryote phức tạp hơn nhiều, mà hiện nay lại được biết ít hơn prokaryote.

Các cơ chế điều hòa sự biểu hiện của gen có thể tác động ở một hay nhiều mức độ khác nhau. Sự điều hòa có thể xảy ra ở mức độ gen bằng sự kiểm soát thời gian và tốc độ phiên mã. Các cơ chế khác có thể hoạt động lúc dịch mã hoặc sau dịch mã.

Ngay trên chất nhiễm sắc có thể thực hiện các kiểu sau:

- DNase cắt một số vùng trên genome làm tháo xoắn để các gen biểu hiện. Hai vùng được lưu ý đó là các vùng nhạy cảm (sensible) và siêu nhạy cảm (hypersensible).

- Các vùng nhạy cảm có liên quan đến các gen có hoạt tính cao và những gen đã qua biểu hiện rồi (như các gen hoạt động ở phôi). Các vùng siêu nhạy cảm liên quan đến các gen có hoạt tính rất cao (như các gen histone).

- DNA Z (DNA trái) là dạng cấu trúc siêu xoắn có thể liên quan đến đóng mở gen.

- Methyl hóa các base. Ở các prokaryote sự methyl hóa có thể thực hiện đối với A và C, còn ở eukaryote sự methyl hóa chỉ thực hiện với C vị trí thứ 5. Methyl hóa làm gen ngừng hoạt động. Ví dụ: nhiễm sắc thể X bất hoạt ở người thuộc loại siêu methyl hóa. Nói chung, sự thay đổi cấu hình (reconfiguration) có thể ảnh hưởng đến sự biểu hiện của gen.

Đây là sự điều hòa ảnh hưởng trực tiếp đến việc mở hoặc đóng của gen. Kiểu điều hòa này thường gặp trong điều hòa trao đổi chất, cũng như các quá trình biệt hóa tế bào.

- Sự tác động của các trình tự cis (gần kề, liền kề) nằm trên cùng mạch DNA như enhancer (vùng tăng cường) làm tăng sự phiên mã.

- Điều hòa bởi các nhân tố trans (cách quãng, từ xa) do các nhân tố không nằm cùng trên một mạch DNA.

- Chọn lựa promoter thích hợp.

- Sự suy yếu/suy thoái.

Sự điều hòa có thể biểu hiện ở mức tác động lên mRNA, chúng ta đã gặp trường hợp trên khi mRNA bị cắt bỏ các intron và gắn các exon lại với nhau để tạo thành mRNA hoàn chỉnh (RNA processing). Như vậy, các hệ thống ảnh hưởng đến sự hoàn chỉnh của mRNA có thể kiểm tra gián tiếp biểu hiện của gen tương ứng. Các mRNA của eukaryote còn có những đoạn không mã hóa liên quan tới thời gian tồn tại và ra khỏi nhân vào tế bào chất.

- Splicing khác nhau.

- Điểm polyadenine hóa khác nhau (polyadenylation).

- Đột biến trên phân tử mRNA.

- Bán chu kỳ phân hủy của mRNA.

- Sự bảo tồn các RNA trong tế bào.

4. Mức độ dịch mã

Sự biến đổi của các nhân tố khởi đầu IF (inititation factor). Là các protein kết hợp với tiểu đơn vị của ribosome vào giai đoạn khởi động của quá trình dịch mã.

Ở đây có sự điều hòa hoạt tính của protein. Sau khi mạch polypeptide được tổng hợp, các protein nhiều khi phải trải qua các biến đổi thứ cấp trước khi biểu hiện hoạt tính (chức năng). Ví dụ: trypsin là enzyme phân giải protein trong dạ dày chỉ có được hoạt tính sau khi chất tiền thân của nó (pro-enzyme không có hoạt tính) bị cắt mất một đoạn polypeptide.

Các protein có thể chịu những biến đổi lập thể như sự kết hợp các enzyme với một số sản phẩm đặc biệt có thể làm thay đổi cấu trúc không gian của chúng dẫn đến mất hoạt tính.

- Các quá trình glycosylation, phosphorylation… tức là gắn thêm các nhóm chất như đường, phosphor… để protein có hoạt tính/chức năng sinh học.

- Peptide tín hiệu là đoạn gồm khoảng 20 amino acid nằm gần phía đầu N của polypeptide, có vai trò gắn polypeptide và ribosome đang tổng hợp mạch này với mạng lưới nội sinh chất. Trong bộ máy Golgi, polypeptide được phóng thích ra ngoài.

- Sự phóng thích ra protein có chức năng sinh học từ một phức hợp, như từ pro-insulin thành insulin.

Các gen được phiên mã tạo RNA, được gọi là các gen cấu trúc. Các protein được dịch mã từ mRNA có thể là enzyme hoặc không phải enzyme. Trong số các protein không phải enzyme có các protein điều hòa (regulatory protein), chúng tương tác với các trình tự DNA đặc hiệu để kiểm soát hoạt tính phiên mã của các gen cấu trúc. Các gen tổng hợp các protein điều hòa được gọi là các gen điều hòa (regulatory gen). Phía trước mỗi gen cấu trúc (hoặc một nhóm gen) có một trình tự promoter, nơi RNA polymerase nhận biết (Hình 8.3). Cơ chế điều hòa ở prokaryote chủ yếu được thực hiện thông qua operon. Đây là khái niệm chỉ tồn tại ở prokaryote.

Thực chất của khởi sự phiên mã là quan hệ trực tiếp giữa RNA polymerase và promoter. Khi RNA polymerase gắn vào promoter, nó sẽ phiên mã tạo phân tử RNA.

Phần lớn promoter ở E. coli về căn bản có cùng cấu trúc:

Nếu base đầu tiên được phiên mã thành mRNA (luôn là purine, thường là adenine) được đánh số +1, thì tất cả các base phía 5’ hay “phía trước” so với nó không được phiên mã là số trừ (). Ngay phía trước +1 có 6 base thường với trình tự TATAAT ở xung quanh 10, và trình tự TTGACA (trình tự liên ứng-consensus sequence) ở xung quanh 35. Cả hai trình tự phối hợp nhau cho phép RNA polymerase gắn vào và khởi sự dịch mã, trình tự 35 tạo điều kiện đầu tiên cho việc gắn vào.

Operon là đơn vị phiên mã gồm ít nhất một promoter và mRNA ở bước tiếp theo để mã hóa cho các trình tự của một hay nhiều chuỗi polypeptide. Tuy nhiên, operon có thể có một hay nhiều điểm điều hòa khác với promoter. Các gen không chịu sự điều hòa do tác động môi trường, tạo sản phẩm thường xuyên, được gọi là các gen cấu trúc. Số lượng sản phẩm của các gen này có thể dao động phụ thuộc vào ái lực tương đối của các promoter của chúng đối với RNA polymerase. Các promoter có ái lực mạnh (strong promoter) tạo ra nhiều sản phẩm của gen hơn các promoter có ái lực yếu. Các gen mà sản phẩm protein của chúng được tổng hợp đáp lại với các nhân tố môi trường, thường được điều khiển bởi một hay nhiều protein điều hòa. Trình tự DNA bên trong operon, nơi mà protein ức chế gắn vào, được gọi là operator (điểm điều hành). Việc gắn protein ức chế lên operator ngăn cản sự phiên mã của tất cả các gen cấu trúc trên cùng một operon. Sự kiểm soát như vậy đối với với gen gọi là kiểm soát âm. Các operon của vi khuẩn thường tạo ra các mRNA đa gen, nhưng mRNA của eukaryote chỉ một gen.

Các protein cần thiết cho biểu hiện gen được gọi là chất hoạt hóa. Chúng có thể gắn với các điểm khởi sự nằm bên trong của promoter của operon hay điểm tăng cường hoặc có thể gắn ở những trình tự xa operon. Việc gắn của protein điều hòa vào điểm khởi đầu (initiator) hay enhancer, kích thích sự phiên mã của các gen cấu trúc, được gọi là cơ chế kiểm soát dương. Sự kích thích để các gen điều hòa phản ứng có thể là từ các phân tử tương đối nhỏ như đường, amino acid đến các phân tử lớn hơn như các phức hợp hormone steroid và các protein thụ thể (receptor). Chất làm cho gen phiên mã được gọi là chất cảm ứng, có tác động ngược với chất kìm hãm. Các gen cảm ứng thường tham gia vào các phản ứng thoái dưỡng (catabolic reaction), như phân hủy các polysaccharide thành đường đơn. Các gen ức chế thường tham gia vào các phản ứng biến dưỡng thực hiện việc tổng hợp các chất như amino acid từ các tiền chất đơn giản hơn.

3. Điều hòa thoái dưỡng: Kiểm soát âm-cảm ứng

Trong thoái dưỡng, các chất thức ăn được phân hủy dễ dàng tạo năng lượng hoặc các chất cần thiết cho quá trình tổng hợp. Cơ chế điều hòa ở đây là sự có mặt của cơ chất (ví dụ lactose) dẫn tới tổng hợp các enzyme phân hủy.

Ví dụ điển hình cho trường hợp này là operon lactose của E. coli. -galactosidase là enzyme có chức năng đôi. Chức năng đầu tiên của nó là thoái dưỡng lactose thành glucose và galactose. Chức năng thứ hai của nó là chuyển liên kết 1-4 của glucose và galactose thành liên kết 1-5 của allolactose. Bình thường enzyme này không hiện diện ở nồng độ cao trong tế bào, khi vắng mặt lactose trong môi trường. Ngay sau khi cho lactose vào môi trường nuôi khi không có glucose, enzyme này bắt đầu được tạo ra. Sự vận chuyển lactose xuyên qua màng tế bào có hiệu quả nhờ protein vận chuyển galactoside permease. Protein cũng xuất hiện với nồng độ cao khi có lactose trong môi trường.

Sự điều hòa của operon lactose còn phụ thuộc vào nồng độ glucose trong môi trường. Nồng độ glucose này lại kiểm soát nồng độ bên trong tế bào của phân tử nhỏ cAMP (cyclic adenosine monophosphate), là chất bắt nguồn từ ATP và làm tín hiệu báo động cho tế bào. Tế bào có xu hướng sử dụng glucose hơn là lactose để làm nguồn carbon vì glucose được biến dưỡng trực tiếp cung cấp carbon và tạo năng lượng. Các enzyme biến dưỡng glucose thuộc loại cấu trúc và tế bào tăng trưởng tối đa với nguồn glucose. Khi nguồn glucose cạn, tế bào phản ứng lại bằng cách tạo ra c-AMP. Việc tăng nồng độ c-AMP trong tế bào gây nên hàng loạt sự kiện, trong sự hiện diện của lactose, dẫn đến sự phiên mã các gen cấu trúc của operon lactose.

3.1. Cấu trúc của operon lactose

Hệ thống lactose (lactose system) bình thường (Hình 8.4) gồm có gen điều hòa (i hoặc R) và operon mang trình tự promoter (P) locus operator (O) và ba gen cấu trúc cho -galactosidase (Z), permease (Y) và transacetylase (A). Nhiều đột biến ở các locus này đã được phát hiện.

3.2. Hoạt động của hệ thống

- Điều kiện cảm ứng (có lactose). Lactose được chuyển vào tế bào rất yếu vì chỉ có vài phân tử permease làm việc. Khi vào trong tế bào, một số lactose (liên kết -1,4) được chuyển thành allolactose (liên kết -1,6) nhờ -galactosidase. Allolactose là chất cảm ứng, nó gắn vào protein kìm hãm và gây biến đổi cấu hình tạo phức hợp allolactose-repressor. Phức hợp này mất khả năng gắn operator. Lúc này operon được mở, RNA polymerase bắt đầu phiên mã các gen cấu trúc. Toàn bộ sự kiện diễn ra như trên hình 8.4b.

- Điều kiện không cảm ứng (không có lactose). Gen điều hòa của operon thường xuyên tổng hợp protein kìm hãm (repressor protein) ở mức độ thấp, vì nó có promoter ít hiệu quả. Sự tổng hợp các protein này bị tác động do nồng độ lactose trong tế bào. Ngược lại, promoter bình thường của operon lac gắn với RNA polymerase rất có hiệu quả. Khi không có đường lactose, protein điều hòa hoạt động (active regulator protein) còn gọi là protein kìm hãm gắn vào promoter hay “đọc” trình tự operator vì protein kìm hãm chiếm đoạn này. Như vậy, sự phiên mã của tất cả các gen cấu trúc của operon lac bị dừng (Hình 8.4a).

Do số lượng permease tăng, nên lactose vào tế bào với số lượng lớn và được phân hủy bởi -galactosidase. Khi lactose được sử dụng hết, các protein kìm hãm gắn trở lại vào operator làm operon bị đóng; sự phiên mã các gen cấu trúc bị dừng.

Bản thân gen điều hòa lacI chỉ có một promoter (P_i) và gen cấu trúc của protein kìm hãm. Promoter này yếu, khi các protein kìm hãm có số lượng lớn, nó bị các protein này gắn vào làm dừng phiên mã.



Hình 8.4. Operon lactose và hoạt động của nó

4. Điều hòa biến dưỡng: Kiểm soát âm-ức chế

Biến dưỡng (anabolism) là quá trình tổng hợp nên các chất cần thiết cho tế bào. Ví dụ tổng hợp các amino acid.

Quá trình tổng hợp tryptophan bắt đầu từ tiền chất tryptophan là chorismic acid, trải qua 5 giai đoạn kế tiếp do enzyme xúc tác. Hệ thống tổng hợp amino acid tryptophan ở E. coli là ví dụ điển hình về operon bị kìm hãm do sự kiểm soát âm.

4.1. Cấu trúc và hoạt động

Hệ thống tryptophan cũng có cấu trúc tương tự hệ thống lactose gồm gen điều hòa trpR và operon tryptophan (promoter, operator và 5 gen cấu trúc). Các gen cấu trúc xác định 5 enzyme được xếp theo thứ tự tương ứng với chức năng xúc tác theo trình tự các phản ứng của chuỗi biến dưỡng tryptophan (Hình 8.5).



Hình 8.5. Operon tryptophan

Sự khác nhau căn bản với hệ thống lactose là ở gen điều hòa. Gen điều hòa của hệ thống tryptophan tổng hợp thường xuyên aporepressor protein, là chất kìm hãm mà riêng nó không có hoạt tính. Khi tryptophan dư thừa nó trở thành chất corepressor (đồng kìm hãm) và kết hợp với aporepressor thành phức hợp kìm hãm (holorepressor) có hoạt tính. Phức hợp này gắn vào operator của operon tryptophan (trp) làm dừng phiên mã các gen cấu trúc. Khi nồng độ tryptophan thấp, nó tách khỏi phức hợp kìm hãm và aporepressor mất hoạt tính. Lúc này các operator lại được mở và RNA polymerase dịch mã 5 gen cấu trúc để tổng hợp 5 enzyme tạo tryptophan (Hình 8.5). Sự điều hòa kiểu này còn gọi là điều hòa ức chế ngược (retro-inhibition) do sản phẩm cuối cùng có mối liên hệ ngược (feed-back).

Như vậy, hoạt động của hệ thống này ngược lại với hệ thống lactose: khi có tryptophan thì operon bị đóng, thiếu tryptophan thì gen được mở.

4.2. Sự suy yếu (attenuation)

Kiểu điều hòa thứ hai được phát hiện ở operon tryptophan được gọi là sự suy yếu. Ở đầu 5’ của mRNA đa gen (polycistronic) của operon này có 5 enzyme. Đoạn này được gọi là trình tự leader (trình tự chỉ huy). Một phần của trình tự này được phiên mã tạo leader peptide gồm 14 amino acid, mà chức năng đến nay chưa rõ.

Cơ chế kiểm tra mà ở đó sự tổng hợp mRNA được bắt đầu nhưng kết thúc sớm với chiều dài mRNA ngắn hơn được gọi là sự suy yếu. Ví dụ: các tế bào E. coli đang tăng trưởng trong môi trường thiếu một amino acid nào đó, nhưng chưa đủ các enzyme cần có cho sự tổng hợp của tất cả 20 amino acid cần thiết để tạo ra protein. Khi thêm một amino acid (tryptophan) vào môi trường sẽ làm giảm đáng kể sự tổng hợp của các enzyme cần cho sự tạo amino acid đó. Phản ứng này có tính thích ứng và duy trì các nguồn enzyme không còn cần nữa khi sản phẩm cuối cùng của chuỗi sinh tổng hợp (tryptophan) đang có trong tế bào (ức chế ngược).

Operon tryptophan có phương thức điều hòa hoạt động gen thứ hai, hoàn toàn độc lập với hệ thống repressor-operator (chất kìm hãm đoạn điều hành). Ở operon tryptophan, sự tổng hợp mRNA bắt đầu từ 161 base trước codon khởi sự của trpE, enzyme cấu trúc đầu tiên được phiên mã. Đột biến do mất đoạn DNA ngay phía trước trpE, giải phóng trpE khỏi sự kìm hãm của phức hợp represser-operator. Các đột biến này làm tăng mức độ biểu hiện của cả operon lên gấp sáu lần. Tinh sạch các DNA được phiên mã in vitro cho thấy phần lớn mRNA kết thúc ở ngay base 139 và không bao giờ đạt tới trpE. Ở đây, có sự kìm hãm phiên mã ngay trước gen cấu trúc và khi mất nó sự biểu hiện của gen có hiệu quả hơn. Đoạn dài của mRNA nằm trước trpE được gọi là leader (trpL) và đoạn kìm hãm phiên mã được gọi là attenuator (trpa, chứ không phải trpA). Cuối cùng, quan sát cho thấy sự suy yếu dao động theo nồng độ của tryptophan thấp, nhiều phân tử mRNA được tạo ra hơn qua attenuator và toàn bộ operon được phiên mã. Sự suy yếu là một phương thức khác để kiểm soát sự biểu hiện của gen.



Hình 8.6. Sự suy yếu xảy ra khi cấu trúc thứ cấp đặc biệt tạo thành trong mRNA. mRNA được trình bày ở đây là từ trình tự leader của operon trp. Nếu tryptophan trong tế bào phong phú và trình tự leader được phiên dịch nhanh, thì mRNA sẽ tạo thành cấu trúc thân và quai (stem-and-loop) hoạt động như là một tín hiệu kết thúc phiên mã.

Cơ chế suy yếu thực hiện sự kết hợp giữa phiên mã và dịch mã. RNA polymerase bắt đầu phiên mã các gen mã hóa cho các enzyme sinh tổng hợp cần thiết để tạo ra tryptophan. Ví dụ: khi hiện diện tryptophan nó nhanh chóng đạt tới điểm (trên RNA mới được tổng hợp) gọi là attenuator và dừng phiên mã tại đây.

Attenuator có chức năng như điểm kết thúc chỉ khi tryptophan hiện diện. Sự phiên mã dừng khi trình tự leader đạt attenuator. Nếu có đủ trytophan trong tế bào, sự dịch mã của các codon được thực hiện, và cả phiên mã và dịch mã được thực hiện hoàn chỉnh cho đến lúc RNA polymerase đạt tới điểm attenuator, nơi kết thúc sự phiên mã. Khi không có trytophan, dịch mã dừng và phần leader của mRNA cuộn lại sao cho attenuator không thực hiện chức năng, trong trường hợp này sự tổng hợp của mRNA toàn vẹn cho operon tryptophan được tạo ra. Với sự hiện diện của các enzyme đó, trytophan được tích lũy với số lượng lớn trong tế bào. Attenuator là dạng tinh tế của sự ức chế, điều hòa hoạt động gen, tạo đặc hiệu cho sự tổng hợp amino acid trong tế bào.

Cơ chế repressor điều hòa thô hệ thống tryptophan, trong khi đó hệ thống cơ chế attenuation kiểm soát nồng độ tryptophan một cách tinh tế. Sự suy yếu của operon Trp cũng nhạy cảm với nồng độ của một số amino acid như histidine và leucine.

Cơ chế điều hòa dương, cảm ứng được tìm thấy ở operon arabinose của E. coli. Arabinose là chất đường, cần ba enzyme (được mã hóa bởi các gen araB, araA và araD) cho sự biến dưỡng. Hai gen khác nằm xa operon góp phần đưa arabinose vào tế bào. Gen điều hòa araC nằm gần các gen B, A và D. Sản phẩm của gen araC là protein kìm hãm của operon khi không có đường arabinose.

Tuy nhiên, khi có đường arabinose trong tế bào, nó gắn với repressor (protein araC) hình thành nên phức hợp activator (hoạt tố) tạo thuận tiện cho sự phiên mã của RNA polymerase.

Trên thực tế, các nghiên cứu cho thấy cơ chế điều hòa này rất phức tạp. Ví dụ: cAMP và protein hoạt hóa thoái dưỡng (catabolite gene activator protein) còn được gọi là CRP (cyclic AMP receptor protein-protein thể nhận cAMP) đều tham gia vào sự điều hòa của hệ thống arabinose.

Các cơ chế điều hòa ở eukaryote có thể xảy ra ở 5-6 mức độ khác nhau (xem mục II). Trong phần này chỉ nhấn mạnh thêm một số đặc điểm của điều hòa hoạt động gen ở eukaryote:

- Ở các operon của prokaryote, các gen điều hòa và các promoter thường nằm gần nhau, nhưng ở eukaryote các gen điều hòa ít khi nằm gần các promoter do chúng kiểm soát.

- Các enhancer là những trình tự cùng nằm trên một phân tử với các promoter có thể có hàng trăm cặp base ở phía trước hoặc phía sau promoter mà chúng kích thích.

- Trình tự điều hòa 5’ ở phía trước có promoter ở eukaryote thường rất dài, có khi hàng chục kilobase (kb).

- Có nhiều kiểu điều hòa ở dạng các nhân tố có tác động từ xa (trans) là các protein.

Sự phiên mã có thể được kích thích bởi các tín hiệu khác nhau. Sự điều hòa hoạt động gen ở prokaryote phần lớn đáp ứng lại các tín hiệu bên trong.

1. Các promoter

Tương tự như ở vi khuẩn, các promoter của eukaryote cùng nằm phía trước điểm xuất phát của mRNA và có những trình tự được bảo tồn trong tiến hóa. Hộp TATA, định hướng cho RNA polymerase bắt đầu phiên mã, nằm khoảng dưới 30 basepair (bp) ở động vật có vú, và 60-120 ở nấm men. Hộp TATA hoạt động có hiệu quả cùng với hai trình tự tương ứng phía trước khoảng 40 bp là CCAAT và 110 bp là trình tự giàu GC.

Sự thay đổi hộp TATA làm giảm tốc độ phiên mã. Hiệu quả của tốc độ phiên mã được đo bằng sự thay đổi của từng base trong promoter, các thay đổi base ngoài hộp TATA và các trình tự phía trước không gây hiệu quả đối với tốc độ phiên mã, trong khi đó các thay đổi ở những yếu tố được nêu trên làm giảm đáng kể tốc độ phiên mã. Khác với promoter của prokaryote, các promoter của eukaryote khó đảm bảo nhận biết các tín hiêu một cách đầy đủ để RNA polymerase khởi sự phiên mã in vitro. Hộp TATA và các trình tự phía trước phải được nhận biết bởi các protein điều hòa, và chính các protein này gắn với các điểm nhất định trên chúng và hoạt hóa sự phiên mã.

2. Các enhancer

Enhancer là các trình tự có tác động cis (liền kề), chúng tăng tốc độ phiên mã đáng kể từ các promoter nằm ngay trên cùng một phân tử DNA. Tính độc đáo của các enhancer là ở chỗ chúng có khả năng thực hiện một cách hiệu quả khi ở một khoảng cách rất xa, có khi đến vài nghìn cặp base. Ngoài ra, chúng có hoạt động chức năng ở bất kỳ hướng nào, dù ở phía trước hay phía sau promoter.

Xét trên một góc độ nào đó, các enhancer tương tự promoter. Cụ thể, chúng được tổ chức gồm một dãy các trình tự có tác động cis để nhận biết các nhân tố tác động từ xa (trans) (Hình 8.8).

3. Các protein là nhân tố có tác động trans

Một vài protein, nhận biết hộp CCAAT, đã được xác định ở tế bào động vật có vú. Các nhân tố này có thể được phân biệt giữa các đơn vị của các phân tử CCAAT. Các hộp GC được nhận biết bởi các nhân tố phụ. Các ví dụ về các tác động trans (trans-acting factor) đã tìm thấy ở nấm men và động vật có vú. Các nhân tố trans có đặc điểm chung là gồm hai vùng cấu trúc và chức năng chính:

- Vùng gắn nhân tố trans vào DNA.

- Vùng tác động lên sự phiên mã.

Đồng thời các nhân tố trans có bốn kiểu tác động như:

- “ngón tay kẽm” (zinc-finger)

- “xoắn-vòng-xoắn” (helix-turn-helix)

- “xoắn-nút-xoắn” (helix-loop-helix)

- “dây kéo leucine” (leucine-zipper) (Hình 8.9).




Hình 8.8. Enhancer của DNA eukaryote

Đặc tính chung của các cấu trúc vừa kể là chúng luôn luôn gắn lên các trình tự cis dưới dạng dimer (gồm hai dimer).

Trình tự cis và nhân tố trans thường có các tương tác đặc hiệu do những liên kết yếu hình thành giữa các phân tử của nhân tố trans với các base của trình tự cis. Ví dụ, trường hợp tương tác giữa các hormone steroid với các enhancer.

Nhiều protein có tác động trans tham gia vào tiến trình phát triển của cơ thể ruồi giấm, chúng có vai trò đặc biệt trong xác định sự sắp xếp các đoạn thân của ruồi.

Như vậy, các gen eukaryote được hoạt hóa bởi hai trình tự DNA có tác động cis là promoter và enhancer, chúng nhận biết được các nhân tố protein có tác động trans, các nhân tố trans cho phép RNA polymerase khởi sự phiên mã và đạt tốc độ phiên mã tối đa.




Hình 8.9. Các kiểu tác động của nhân tố trans


4. Hormone

Ví dụ rõ nhất về các chất điều hòa nội tại của hoạt tính gen là hormone. Đó là những chất tạo ra do một loạt tế bào có hiệu quả đến các tế bào khác. Các hormone thường được vận chuyển đến các phần của cơ thể nhưng chỉ tác động đến các tế bào có các receptor tương ứng.

Sự tương tác giữa hormone với receptor gây ra tín hiệu tác động đến các vùng đặc trưng của DNA, gây hoạt hóa gen hoặc một nhóm gen tương ứng.

Các hormone có thể kích thích phiên mã bởi một trong các cơ chế sau:

- Hormone có thể làm cho DNA tách khỏi histone và tạo điều kiện cho RNA polymerase bắt đầu phiên mã.

- Có thể làm chất cảm ứng (inducer) gây bất hoạt phân tử receptor.

- Có thể gắn trực tiếp với đoạn DNA đặc hiệu tạo thuận lợi cho việc gắn RNA polymerase hoặc protein là nhân tố phiên mã (protein transcription factor).

- Có thể hoạt hóa effector protein làm thành phức hợp gắn DNA và kích thích gắn RNA polymerase.

- Có thể gắn với protein tạo phức hợp hoạt hóa kích thích gắn RNA polymerase.

5. Kiểm soát các chất thường gặp trong nhân

Một số nhóm phân tử hiện diện rất nhiều trong mỗi tế bào eukaryote, như các histone, các chất của bộ máy dịch mã, các cấu phần của màng… Vài chương trình khác nhau được thực hiện để duy trì số lượng đủ lớn của chúng trong tế bào. Các chương trình đó gồm:

- Sự phiên mã liên tục và lặp lại trong tế bào.

- Sự lặp lại các gen.

- Sự khuếch đại ngoài nhiễm sắc thể các trình tự gen đặc hiệu.

5.1. Sự phong phú

Các gen mã hóa cho rRNA và tRNA đã được nghiên cứu kỹ. Phản ứng lai đơn giản DNA-RNA cho thấy nhiễm sắc thể của Xenopus có vùng tổ chức hạch nhân (nucleolus organizer) chứa 450 bản sao của DNA mã hóa cho 18S và 28S rRNA. Ngược lại, trong mỗi nhân có 20.000 bản sao của các gen mã hóa cho 5S rRNA và các gen này không nằm ở vùng tổ chức hạch nhân.

Các gen mã hóa cho histone cũng có với nhiều bản sao được lặp lại hàng trăm lần.

Sự phong phú của các gen nêu trên đảm bảo đủ số lượng cần thiết cho dịch mã khi phải tổng hợp hàng triệu phân tử protein vào lúc cần thiết.

5.2. Sự khuếch đại gen

Một ví dụ về sự khuếch đại gen trong nhân là các chỗ phình (puff) của nhiễm sắc thể khổng lồ hay đa sợi (polytene chromosome) ở tuyến nước bọt của ruồi giấm. Ở các chỗ phình này, DNA nguyên nhiễm sắc (euchromatic) được khuếch đại khoảng vài nghìn lần.

Trong nhân tế bào trứng của Xenopus, có hàng trăm nhân con ngoài nhiễm sắc thể (extrachromosome nucleoli) với kích thước khác nhau, mỗi nhân con chứa các vòng tròn rDNA kích thước khác nhau, mà vai trò đến nay chưa rõ. Các DNA vòng tròn này sản sinh nhiều rRNA ở mức hợp lý.

Ở các sinh vật bậc cao cũng như ở người, cơ thể trưởng thành gồm nhiều loại tế bào khác nhau. Các tế bào này đều bắt nguồn từ một hợp tử ban đầu, nhưng đã qua quá trình biệt hóa trở thành các tế bào có các chức năng khác nhau. Tuy nhiên, thực nghiệm xác định rằng số lượng nhiễm sắc thể, số lượng DNA và cả tỷ lệ (A+T)/(G+C) của các tế bào thuộc các mô khác nhau của cùng một cơ thể đều giống nhau. Sử dụng kỹ thuật lai DNA cho thấy DNA từ những tế bào của các mô khác nhau của cùng một cơ thể không bị biến đổi trong quá trình biệt hóa, chúng có thể tự hồi tính (renaturation) với nhau.

Thí nghiệm ghép nhân tế bào ruột ếch vào tế bào trứng bị hỏng nhân (do chiếu tia tử ngoại) cho thấy 1% tế bào ghép nhân phát triển thành ếch trưởng thành. Điều này chứng tỏ tế bào ruột tuy đã biệt hóa vẫn giữ nguyên vẹn thông tin di truyền để tạo ra ếch trưởng thành.

Tóm lại, số lượng DNA của các tế bào biệt hóa về căn bản giống với các hợp tử ban đầu và chứa nguyên vẹn thông tin di truyền đủ để phát triển thành cá thể nguyên vẹn.

Để hiểu được sự khác nhau giữa các tế bào biệt hóa, cần xét nhiều vấn đề sau:

- Thứ nhất, nhiều quá trình là chung cho tất cả các tế bào nên có nhiều protein giống nhau. Những protein này gồm số lượng nhiều, dễ phân tích như phần lớn các protein cấu trúc của thành tế bào và nhiễm sắc thể; một số protein căn bản của các bào quan (lưới nội sinh chất, bộ máy Golgi, các ribosome…). Nhiều protein có số lượng không nhiều như các enzyme khác nhau, tham gia vào các phản ứng trung tâm của quá trình trao đổi chất, đều hiện diện như nhau ở tất cả các kiểu tế bào.

- Thứ hai, một số protein có số lượng phong phú ở một số tế bào chuyên hóa mà việc phát hiện chúng cần có thử nghiệm riêng. Ví dụ, hemoglobin chỉ có thể phát hiện ở tế bào máu.

- Thứ ba, nếu như hơn 2.000 loại protein có số lượng dồi dào được so sánh giữa các kiểu tế bào biệt hóa của cùng một vi sinh vật với nhau bằng điện di hai chiều polyacrylamide, thì một số khác biệt đáng kể sẽ được tìm thấy. Dù sự so sánh giữa hai dòng tế bào nuôi cấy (như các dòng tế bào cơ và thần kinh) hay giữa các tế bào của cùng một mô của chuột (như gan và phổi), đại đa số các protein được phát hiện đều được tổng hợp ở cả hai loại tế bào và với tốc độ tổng hợp có thể khác nhau đến 10⁵; chỉ có vài trăm protein hiện diện với số lượng khác nhau đáng kể ở hai kiểu tế bào.

Các nghiên cứu cho thấy các tế bào eukaryote bậc cao tổng hợp từ 10.000-20.000 protein khác nhau. Phần lớn chúng có số lượng rất ít và khó phát hiện. Nếu các protein hiếm (minor protein) này khác nhau giữa các tế bào với mức độ tương tự các protein dồi dào, thì chỉ một số lượng nhỏ của chúng cũng đủ tạo nên nhiều khác biệt chuyên hóa lớn về hình thái và sinh lý của tế bào.

Tế bào có thể thay đổi sự biểu hiện gen của chúng đáp lại tín hiệu bên ngoài.

Phần lớn các tế bào chuyên hóa của sinh vật đa bào có khả năng thay đổi phương thức biểu hiện của gen để đáp lại tác động bên ngoài. Ví dụ: nếu tế bào bị tác động bởi glucocorticoid hormone, thì sự tổng hợp một số protein chuyên biệt được tăng vọt (Hình 8.10). Glucocorticoid được phóng thích ra khi bị đói bụng hay hoạt động mạnh và báo hiệu cho gan tăng cường tạo glucose từ amino acid hay các phân tử nhỏ khác nhau. Các protein, được tạo ra do các enzyme cảm ứng như tyrosine aminotransferase hỗ trợ biến tyrosine thành glucose. Khi hormone không còn nữa, sự tổng hợp các protein này giảm xuống mức bình thường.

Các loại tế bào khác nhau phản ứng với glucocorticoid bằng nhiều cách khác nhau. Ví dụ ở tế bào mỡ, sự tổng hợp tyrosine transferase giảm, trong khi đó một số loại tế bào khác hoàn toàn không có phản ứng với glucocorticoid. Các ví dụ này minh họa cho tính chất chung của biệt hóa là các kiểu tế bào biệt hóa khác nhau thường phản ứng lại cùng một tín hiệu bên ngoài bằng nhiều cách khác nhau. Trên cơ sở đó, mỗi kiểu tế bào biệt hóa có một đặc tính ổn định thường xuyên. Các tính chất đó phản ánh sự biểu hiện lâu bền của các nhóm gen khác nhau.




Hình 8.10. Tác dụng của glucocortcoid làm tăng mức độ biểu hiện của gen

Như vậy, các tế bào biệt hóa chỉ sử dụng một phần thông tin. Nhiều loại tế bào chuyên hóa tổng hợp chủ yếu một số protein, ngoài các protein cấu trúc và protein cơ bản sử dụng cho các quá trình sinh lý bình thường. Ví dụ: tế bào cơ tổng hợp nhiều myosin, một protein quan trọng trong co cơ, hay tế bào biểu bì (epithelial) tổng hợp nhiều keratine. Như vậy, cũng như chứa thông tin di truyền giống nhau, nhưng mỗi loại tế bào biệt hóa chỉ sử dụng một phần thông tin: tổng hợp chủ yếu một số loại protein .

Nếu những sự biệt hóa giữa các kiểu tế bào khác nhau phụ thuộc vào các gen chuyên biệt mà tế bào biểu hiện, thì sự kiểm soát biểu hiện gen được thực hiện ở mức độ nào?

Giả thuyết được chấp nhận hiện nay là trong các tế bào biệt hóa một số gen phiên mã, còn có các gen khác thì không. Không có sự kiện nào mâu thuẫn với giả thuyết này và nó giải thích hợp lý hơn cả tình trạng biệt hóa của các tế bào. Đối với phần lớn gen, sự kiểm soát phiên mã có tầm quan trọng hàng đầu, vì chỉ nó mới đảm bảo cho sự tổng hợp không dư thừa các chất trung gian.

Việc phát hiện các gen điều hòa và các gen đóng hay mở giúp hiểu được sự điều hòa quá trình phát triển cá thể và biệt hóa tế bào. Genome đơn bội của tế bào người có số lượng DNA nhiều hơn gấp 1.000 lần so với genome của vi khuẩn. Tuy nhiên, số lượng gen cấu trúc ở người chỉ lớn hơn 10 lần số gen cấu trúc vi khuẩn. Điều đó cho thấy nhiều gen ở người tham gia vào các cơ chế điều hòa.

Tóm lại, genome của tế bào chứa các trình tự nucleotide của DNA thông tin để tạo ra hàng nghìn các protein và phân tử RNA khác nhau. Tế bào chỉ biểu hiện điển hình một nhóm gen của nó và các kiểu tế bào biệt hóa khác nhau ở sinh vật đa bào được sản sinh ra do các nhóm gen khác nhau có sự biểu hiện không giống nhau. Hơn thế nữa, các tế bào có thể thay đổi phương thức biểu hiện các gen của chúng để đáp lại những thay đổi của môi trường, các tín hiệu đó từ các tế bào khác. Mặc dù tất cả các bước trong sự biểu hiện của gen về căn bản đều được điều hòa, nhưng đối với phần lớn các gen việc khởi sự phiên mã là điểm kiểm soát quan trọng nhất.


Tài liệu tham khảo/đọc thêm

1. Phạm Thành Hổ. 2003. Di truyền học. NXB Giáo dục, Hà Nội.

2. Lê Đức Trình. 2001. Sinh học phân tử của tế bào. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

3. Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K and Watson JD. 2002. Molecular Biology of the Cell. 3^rd ed. Garland Publishing, Inc. New York, USA.

4. Karp G. 2002. Cell and Molecular Biology: Concepts and Experiments. 3^rd ed. John Wiley & Sons, Inc. New York, USA.

5. Lewin B. 2000. Gene VII. Oxford University Press, Oxford, UK.

6. Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser CA, Krieger M, Scott MP, Zipursky SL and Darnell J. 2004. Molecular Cell Biology. 5^th ed. Freeman and Company, New York, USA.

7. Walker JM and Rapley R. 2000. Molecular Biology and Biotechnology. Chapman & Hall Limited, London, UK.

8. Watson JD, Hopkins NH, Roberts JW and Weiner AM. 2004. Molecular Biology of the Gene. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. California, USA.

9. Weaver RF. 2003. Molecular Biology. 2^nd ed. McGraw-Hill Company, New York, USA

Chương 9


Công nghệ DNA tái tổ hợp

I. Mở đầu

Vào năm 1973, một nhóm các nhà khoa học đã tạo ra cơ thể sinh vật đầu tiên với các phân tử DNA tái tổ hợp. Theo đó, Cohen (ĐH Stanford, Mỹ) và Boyer (ĐH California, Mỹ) cùng các cộng sự đã đưa được một đoạn DNA từ một plasmid này vào một plasmid khác, tạo ra một plasmid hoàn toàn mới, plasmid tái tổ hợp. Sau đó, họ đưa plasmid tái tổ hợp vào trong các tế bào E. coli. Trong một thời gian ngắn, các tác giả này đã dùng các phương pháp giống nhau để gắn các gen từ hai loại vi khuẩn khác nhau, cũng như để chuyển các gen từ ếch vào vi khuẩn. Các thí nghiệm này đánh dấu một cuộc cách mạng vô cùng quan trọng trong lịch sử nghiên cứu khoa học của nhân loại.

Công nghệ DNA tái tổ hợp là một tập hợp các kỹ thuật phân tử để định vị, phân lập, biến đổi và nghiên cứu các đoạn DNA. Thuật ngữ tái tổ hợp được dùng thường xuyên do mục tiêu của nó là phối hợp DNA từ hai nguồn xa nhau. Ví dụ: các gen từ hai nguồn vi khuẩn khác nhau có thể được liên kết lại, hoặc một gen người có thể được đưa vào nhiễm sắc thể vi khuẩn. Công nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi là công nghệ di truyền, công nghệ gen hay kỹ thuật gen…) hiện nay bao gồm một mạng lưới các kỹ thuật phân tử được dùng để phân tích, biến đổi và tái tổ hợp hầu như mọi trình tự DNA.


1. Tác động của công nghệ DNA tái tổ hợp

Công nghệ DNA tái tổ hợp đã biến đổi sâu sắc phương thức nghiên cứu gen. Trước đây, thông tin về cấu trúc và tổ chức của gen thu được bằng cách kiểm tra biểu hiện kiểu hình của chúng, nhưng những kỹ thuật mới đã tạo ra khả năng tự đọc các trình tự nucleotide. Trước đây, các nhà di truyền phải chờ đợi sự xuất hiện các đột biến ngẫu nhiên hoặc cảm ứng để phân tích hiệu quả của sự sai khác di truyền, ngày nay họ có thể tạo ra đột biến ở các điểm nhất định một cách chính xác và xem chúng thay đổi kiểu hình như thế nào.

Công nghệ DNA tái tổ hợp đã cung cấp các thông tin mới về cấu trúc và chức năng của gen và đã thay đổi nhiều khái niệm cơ bản của di truyền học. Ví dụ: trong khi mã di truyền được xem là rất phổ biến, thì bây giờ chúng ta còn biết rằng các mã không phổ biến cũng tồn tại trong DNA ty thể. Trước đây, chúng ta nghĩ rằng tổ chức của các gen eukaryote giống với prokaryote, nhưng bây giờ chúng ta biết rằng nhiều gen eukaryote bị gián đoạn bởi các intron. Ngày nay, chúng ta đã biết đầy đủ hơn về các quá trình tái bản, phiên mã, dịch mã, biến đổi RNA (RNA processing) và điều hòa gen thông qua việc sử dụng các kỹ thuật tái tổ hợp DNA. Các kỹ thuật này cũng được dùng trong nhiều trong nhiều lĩnh vực khác, bao gồm hóa sinh học, vi sinh vật học, sinh học phát triển, sinh học thần kinh, tiến hóa và sinh thái học.

Công nghệ DNA tái tổ hợp cũng được ứng dụng để tạo ra nhiều sản phẩm thương mại, chẳng hạn: thuốc, hormone, enzyme và các giống cây trồng-vật nuôi. Một nền công nghiệp hoàn toàn mới, công nghiệp công nghệ sinh học, đã phát triển chung quanh việc sử dụng các kỹ thuật này để tạo ra các sản phẩm mới. Trong y học, các kỹ thuật tái tổ hợp DNA được dùng để thăm dò bản chất của ung thư, chẩn đoán các bệnh di truyền và nhiễm trùng, sản xuất thuốc và điều trị các rối loạn di truyền.

Kỹ thuật gen cho thấy một loạt cơ hội, mở ra các phương thức cần thiết (mà trước đây có thể không được) gần như là hiển nhiên. Vấn đề cơ bản đó là các gen có kích thước quá nhỏ và có hàng ngàn gen ở trong mỗi tế bào. Thậm chí, khi quan sát trên kính hiển vi mạnh nhất, thì DNA xuất hiện như là một sợi dây bé xíu, các nucleotide riêng rẽ không thể thấy, và không có một dấu hiệu nào về các đường nét vật lý ở chỗ bắt đầu và kết thúc của một gen.

Để minh họa vấn đề này, chúng ta hãy xem xét một ví dụ đặc trưng về di truyền phân tử như sau: Giả thiết rằng chúng ta muốn phân lập một gen đặc biệt của người và đặt nó vào trong vi khuẩn để sản xuất một lượng lớn các protein người đã được mã hóa. Vấn đề đầu tiên là tìm được gen mong muốn. Genome đơn bội của người chứa khoảng 3,3 tỷ cặp base của DNA. Giả sử gen mà chúng ta muốn phân lập dài 3.000 bp. Như vậy, gen đích của chúng ta chỉ chiếm một phần triệu của genome; vì thế để tìm kiếm gen của chúng ta trong một genome đồ sộ như thế là khó khăn hơn rất nhiều so với việc tìm kiếm một cây kim trong một đống cỏ khô. Nhưng thậm chí, nếu chúng ta có thể định vị gen, thì chúng ta sẽ tách nó ra khỏi genome như thế nào? Không có forcept đủ nhỏ để gắp một mảnh DNA đơn, và cũng không có một cái kéo cơ học nào đủ nhỏ để cắt ra khỏi genome một đoạn gen riêng biệt.

Nếu chúng ta thành công trong việc định vị và phân lập gen mong muốn, thì bước tiếp theo chúng ta cần đưa nó vào trong tế bào vi khuẩn. Các đoạn DNA mạch thẳng sẽ bị thoái biến nhanh bởi vi khuẩn; vì thế gen phải được chèn vào trong một dạng ổn định. Nó cũng phải ổn định để tái bản thành công hoặc nó sẽ không được phân chia tiếp khi tế bào phân chia.

Nếu chúng ta chuyển gen vào vi khuẩn thành công trong một dạng ổn định, chúng ta vẫn còn phải đảm bảo rằng gen được phiên mã và dịch mã. Sự biểu hiện của gen là một quá trình phức tạp đòi hỏi một số các trình tự DNA khác nằm ở bên ngoài gen. Tất cả những trình tự này phải hiện diện trong các hướng ở các vị trí thích hợp của chúng để sản xuất protein.

Cuối cùng, các phương pháp được sử dụng để phân lập và chuyển gen có hiệu quả vô cùng thấp, trong hàng triệu tế bào được hướng tới cho các phương thức này, chỉ có một tế bào có thể chọn lọc thành công và biểu hiện gen của người. Vì thế, chúng ta phải tìm kiếm nhiều tế bào vi khuẩn để phát hiện được một tế bào mang DNA tái tổ hợp.

Trước đây, các vấn đề này dường như là không vượt qua được. Nhưng ngày nay, các kỹ thuật phân tử được phát triển để khắc phục chúng, và các gen người được chuyển dễ dàng vào các tế bào vi khuẩn và ở đó chúng sẽ được biểu hiện tốt.


II. Endonuclease hạn chế

Trong tự nhiên, các enzyme endonuclease hạn chế (restriction endonuclease, RE), gọi tắt là enzyme hạn chế, hiện diện trong hầu hết các tế bào vi khuẩn để ngăn cản DNA ngoại lai tiếp quản bộ máy tổng hợp protein của tế bào. DNA của chính chúng sẽ được bảo vệ khỏi tác dụng của enzyme hạn chế nhờ sự có mặt của các enzyme nội bào có thể methyl hóa (methylation) các nucleotide đặc biệt, vì thế các nucleotide này không được nhận biết bởi các enzyme hạn chế.

Việc phát hiện ra các enzyme hạn chế của vi khuẩn cắt DNA ở những trình tự đặc biệt, đã giúp cho việc thao tác gen dễ dàng hơn, do nó có thể giảm chiều dài của các phân tử DNA thành một tập hợp bao gồm các đoạn ngắn hơn. Hiện nay, các enzyme hạn chế được phân lập từ các sinh vật prokaryote.

Mỗi enzyme hạn chế chỉ nhận biết và cắt một trình tự DNA đặc biệt thường chứa bốn hoặc sáu cặp nucleotide. Ví dụ enzyme EcoRI tách chiết từ E. coli cắt trình tự GAATTC, enzyme BalI của Brevibacterium albidum cắt trình tự TGGCCA. Có hơn 900 enzyme hạn chế khác nhau được tinh sạch từ khoảng 250 chủng vi sinh vật. Các enzyme hạn chế cắt các phân tử DNA sợi đôi theo hai cách khác nhau (Hình 9.1):

- Cắt trên một đường thẳng đối xứng để tạo ra các phân tử đầu bằng (đầu thô).

- Cắt trên những vị trí nằm đối xứng quanh một đường thẳng đối xứng để tạo ra những phân tử đầu so le (đầu dính).

Vì một enzyme hạn chế chỉ nhận biết một trình tự duy nhất, cho nên số vị trí cắt trên một phân tử DNA đặc biệt thường là nhỏ. Các đoạn DNA được cắt bởi enzyme hạn chế có thể được phân tách theo kích thước bằng điện di agarose gel để nghiên cứu. Do sự tương tự của tổ chức phân tử trong tất cả các cơ thể, cho nên DNA vi khuẩn, DNA thực vật và DNA động vật có vú tương hợp nhau về cấu trúc. Vì thế, một đoạn DNA từ một dạng sống này có thể dễ dàng được pha trộn với DNA của một dạng sống khác. Sự tương tự này cũng phù hợp đối với plasmid, nhân tố di truyền ngoài nhân được tìm thấy trong nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Chúng là những phân tử DNA mạch vòng đóng sợi đôi được dùng làm vector mang các đoạn DNA ngoại lai dùng trong kỹ thuật tái tổ hợp DNA.

Giống như EcoRI, nhiều enzyme hạn chế đã tạo ra các đoạn DNA với đầu 5’ lồi (protruding). Một số enzyme hạn chế (ví dụ: PstI) đã tạo ra các đoạn DNA có đầu 3’ lồi. Một số enzyme hạn chế khác (ví dụ: BalI) cắt ở trục đối xứng để tạo ra các đoạn DNA mang đầu bằng (blunt) (Bảng 9.1).