TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Đình Dũng nghiên cứu tuyển chọn VI khuẩn malolactic và Ứng dụng trong công nghệ SẢn xuất rưỢu vang luận văn thạc sĩ khoa họC
Các phương pháp lên men malolactic và khả năng ứng dụng để nâng cao chất lượng rượu vang
tải về 0.69 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu, chủng vi sinh và hóa chất 2.1.1 Nguyên liệu
- 2.1.2 Vi sinh vật
- Dụng cụ máy móc, thiết bị Các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu, phân tích của Viện Công nghiệp thực phẩm. 2.2 Phương pháp nghiên cứu
- Hình 2.1 Sơ đồ phân lập vi khuẩn malolactic từ nguồn nguyên liệu quả và lá nho
- 2.2.3 Phương pháp phân tích lý hóa
- CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn malolactic cho sản xuất rượu vang
- Bảng 3.1. Đặc tính sinh lý của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được
Các phương pháp lên men malolactic và khả năng ứng dụng để nâng cao chất lượng rượu vang Rượu vang mới chỉ xuất hiện ở nước ta cách đây hơn 100 năm nhưng nó đã nhanh chóng trở thành thứ đồ uống không thể thiếu. Tuy nhiên, mức tiêu thụ rượu vang bình quân tính theo đầu người hiện nay ở nước ta còn thấp, chỉ là 3-5 lít/năm. Do gặp nhiều khó khăn về thiết bị và qui trình công nghệ lạc hậu nên chất lượng vang Việt nam chưa cao. Để đáp ứng nhu cầu của thị trường, chúng ta đã thay đối qui trình công nghệ, rút ngắn thời gian lên men và dịch siro quả trước khi lên men bị đem thanh trùng nhằm tiêu diệt vi sinh vật nhiễm tạp và cũng vô tình tiêu diệt luôn quần thể vi khuẩn L.oenos quí giá có trong nguyên liệu còn sót lại sau quá trình xử lý. Chính vì vậy quá trình lên men malolactic không được thực hiện, khiến cho vang có vị chua “cứng”, chất lượng không ổn định, nhanh đục và hay bị nhiễm tạp. Chúng ta không sản xuất được rượu vang có chất lượng giống như rượu ngoại và do vậy chịu nhiều thua thiệt về giá cả, giá thành rượu nội chỉ bằng 5-10% so với rượu ngoại tương ứng và gây tiêu tốn ngoại tệ cho việc nhập khuẩn rượu [7]. Sản xuất vang theo truyền thống thì lên men malolactic diễn ra tự phát trong suốt quá trình bảo quản vang non trong thời gian vài tháng hoặc nhiều năm. Vi khuẩn có nguồn gốc trên vỏ quả nho hoặc ở thùng gỗ. Tuy nhiên, trong công nghệ sản xuất vang hiện đại với quá trình chế biến sạch hơn và thời gian bảo quản cần giảm tối thiểu thì quá trình lên men như vậy quá chậm chạp và không đủ độ tin cậy. Như vậy lên men malolactic tự nhiên có những ưu điểm là thuận lợi và rẻ tiền, nhưng nhược điểm cũng rất nhiều như là: khó khởi động, diễn ra rất chậm chạp và khó kiểm soát được các chủng vi khuẩn tham gia vào quá trình dẫn đến việc tạo các sản phẩm phụ không mong muốn. Để khắc phục, hiện nay người ta thường áp dụng phương pháp chủ động đưa vi khuẩn L.oenos thuần chủng vào môi trường để thực hiện lên men malolactic. Việc cấy vi khuẩn có thể diễn ra trong quá trình lên men rượu (đồng thời với nấm men) hoặc sau khi hoàn thành quá trình lên men rượu [3,18,38]. Để khắc phục hiện trạng thực tế này người ta đã sử dụng vi khuẩn thuần khiết để thực hiện quá trình lên men malolactic. Ưu điểm của các chủng vi khuẩn này là có khả năng thích nghi cao với môi trường rượu vang non có độ cồn cao (15% v/v), pH thấp (3,0) và có khả năng lên men mạnh các loại đường, đặc biệt là lên men axít malic thành lactic và axít xitric thành axetic. Có nhiều phương pháp sử dụng vi khuẩn O.oeni thuần khiết để thực hiện quá trình lên men malolactic nhưng nhìn chung dựa vào hai phương pháp sau đây: Lên men một giai đoạn (lên men hỗn hợp): Lên men một giai đoạn có nghĩa là người ta cấy nấm men và vi khuẩn đồng thời trong quá trình lên men rượu. Phương pháp này có những ưu điểm: vi khuẩn sẽ có điều kiện sinh trưởng tốt hơn trong môi trường có nồng độ cồn thấp và khi hàm lượng cồn tăng dần trong quá trình lên men rượu thì vi khuẩn sẽ được thích nghi dần với môi trường chứa rượu, chứ không bị sốc như khi đột ngột gặp môi trường có nồng độ cồn cao, hơn nữa khi đó môi trường còn đang rất giàu chất dinh dưỡng nên thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Nuôi cấy hỗn hợp còn tạo điều kiện cho sự lên men malolactic xảy ra đồng thời với lên men rượu, nếu lên men malolactic không xảy ra tức thời thì có thể là do tỉ lệ vi khuẩn trong dịch lên men quá ít hoặc do hàm lượng SO2 quá cao đã ức chế vi khuẩn [2]. Tuy nhiên, phương pháp này cũng có hạn chế: đó là là sự cạnh tranh không lành mạnh chất dinh dưỡng và quan hệ đối kháng giữa vi khuẩn và nấm men. Sự chuyển hóa đường của vi khuẩn lactic để sinh ra axit lactic gây ảnh hưởng đến hiệu suất quá trình lên men rượu của nấm men và chất lượng rượu vang. Bên cạnh đó, khi vi khuẩn lactic phát triển mạnh sinh ra quá nhiều axít lactic và axetic gây ra sự mất cân bằng vị trong rượu vang làm mất giá trị cảm quan của sản phẩm. Phương pháp này chỉ thực hiện khi các chủng vi sinh vật đã được lựa chọn kĩ, không có tính đối kháng và lượng tế bào cần có của mỗi chủng được xác định. Do vậy, phương pháp lên men hai giai đoạn đã được tiến hành[7]. Lên men hai giai đoạn liên tiếp là quá trình lên men rượu và lên men malolactic riêng biệt. Sau khi lên men rượu bởi nấm men kết thúc, đưa vi khuẩn vào thực hiện giai đoạn lên men phụ (lên men malolactic). Phương pháp này có ưu điểm sau: Cho phép điều chỉnh một cách dễ dàng các yếu tố môi trường thích hợp cho từng loài, điều này giúp thời gian lên men của mỗi giai đoạn có thể rút ngắn không ảnh hưởng đến hiệu suất lên men rượu vì nuôi cấy hai chủng riêng, cuối quá trình lên men, do nồng độ đường còn rất thấp nên lúc này vi khuẩn lactic buộc phải sử dụng các axit hữu cơ làm nguồn cơ chất chính để tồn tại. pH dịch lên men lúc này đã giảm còn khoảng 3.5 – 4, đây là khoảng pH thích hợp cho việc chuyển hóa axit malic nguy cơ đường bị chuyển hóa thành các sản phẩm khác như axit lactic, axit axetic giảm[7]. Nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là khi kết thúc lên men rượu nồng độ cồn trong môi trường cao khoảng 12 – 15%v/v, do đó khi cấy vi khuẩn vào môi trường do gặp nồng độ cồn cao đột ngột nên vi khuẩn sẽ bị sốc, số lượng giảm đáng kể nên sẽ làm chậm quá trình lên men malolactic. Do vậy mà phải chọn được các chủng vi khuẩn có khả năng chịu được độ cồn cao và dùng phương pháp nuôi cấy trước, tức là nuôi vi khuẩn trong các môi trường giàu dinh dưỡng có bổ sung cồn ở khoảng pH 4,5 trong 5 – 7 ngày để vi khuẩn thích ứng dần sau đó mới đưa vào vang non, qua đó có thể khắc phục tình trạng chết của vi khuẩn một cách đáng kể. Trong thực tế, không có một phương pháp nào chung cho việc khởi động quá trình lên men malolactic, vì vậy khi đưa một chủng vi khuẩn nào vào thực hiện quá trình này cần thiết phải xác định thời điểm bổ sung thích hợp chủng giống này. CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.1 Nguyên liệu - Syro nho nhập khẩu của Ý có nồng độ chất khô 65°Bx - Chế phẩm Essential oenos (EO) do công ty Gusmer Enterprises cung cấp: là chế phẩm chứa chất dinh dưỡng cần cho sự sống sót của vi khuẩn malolactic, bao gồm các vitamin, các axit amin và muối khoáng. - Enzym Pectinex Ultra SP-L và Pectinex 3XL của hãng NoVo (Đan Mạch), mua tại Công ty EAC (Việt Nam). 2.1.2 Vi sinh vật - Chủng nấm men: Chủng nấm men S.cerevisiae SH09 phân lập tại Ninh Thuận năm 2008. 2.1.3 Môi trường phân lập vi sinh vật Môi trường phân lập vi khuẩn lactic (MRS)
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn malolactic Sử dụng môi trường MRS có bổ sung axít malic: môi trường MRS: 1 lít; axít malic: 5g; pH 5 (điều chỉnh bằng KOH 10N) và thạch: 30g. Môi trường lên men malolactic nước nho axít AG (Acide Grape) - Glucoza: 10g - Pepton: 10g - Cao nấm men: 5g - Axít malic: 2g - MgSO4.7H2O: 0,05g - Nước nho: 250 ml, định mức bằng H2O cất đến 1000ml, điều chỉnh pH về 4,8 bằng KOH 10N. 2.1.4 Hóa chất Các hoá chất phân tích sử dụng của Merck (Đức), Sigma (Mỹ), BDH (Anh), A.R. (Trung Quốc) và bộ kít chuẩn enzyme (Cat.No.10139068035) của BOEHRINGER MANNHEIN (Đức).
Các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu, phân tích của Viện Công nghiệp thực phẩm. 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Quy trình lên men rượu vang Sy rô nho được pha với tỷ lệ 20%, sau đó bổ sung đường kính để đạt nồng độ chất khô 250 Bx. Lên men bằng chủng nấm men S.cerevisiae SH09. Kết thúc quá trình này, tiếp tục lên men dịch trong vòng 10 ngày ở nhiệt độ 25°C, thu được rượu vang non. Bổ sung vi khuẩn malolactic (tỷ lệ giống 106 tế bào/ml) để tiến hành lên men malolactic. Bổ sung vi khuẩn malolactic (tỷ lệ giống 106 tế bào/ml) để tiến hành lên men malolactic. Mẫu ĐC: Lên men malolactic tự phát Mẫu F: Lên men Malolactic, cấy vi khuẩn lactic ngay đầu quá trình lên men rượu. Mầu M: Lên men malolactic, cấy vi khuẩn lactic khi quá trình lên men rượu được 48h. Mẫu E: Lên men malolactic, cấy vi khuẩn lactic khi quá trình lên men rượu vừa kết thúc.
- Phương pháp phân lập vi khuẩn malolactic từ nguồn nguyên liệu quả, lá nho 
Hình 2.1 Sơ đồ phân lập vi khuẩn malolactic từ nguồn nguyên liệu quả và lá nho - Phương pháp xác định khả năng lên men của chủng vi khuẩn malolactic Lấy một đầu que cấy giống vi khuẩn malolactic từ khuân lạc trên đĩa petri hoặc ống thạch nghiêng rồi cấy vào 10-50 ml môi trường lên men malolactic dịch vang non sau khi lên men rượu của bộ môn thực phẩm và dinh dưỡng Viện Công nghiệp Thực phẩm cung cấp và lọc vô trùng bằng màng 0,45 micromet. Lên men ở nhiệt độ 250C. Lấy mẫu hàng ngày để kiểm tra hàm lượng axít malic bị tiêu thụ hoặc hàm lượng axít lactic tạo thành. - Phương pháp xác định hình thái, kích thước tế bào và nảy chồi của các chủng vi khuẩn malolactic trên kính hiển vi. - Phương pháp xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu đánh them phương pháp [1]. - Phương pháp xác định tế bào Gram + theo Collin, 1989 [15]. Phương pháp xác định vi khuẩn kỵ khí bằng khả năng tạo khuẩn lạc trên đĩa thạch MRS trong bình đã loại bỏ oxy [43]. - Phương pháp xác định vi khuẩn hiếu khí bằng khả năng sinh hoạt tính catalaza trên môi trường thạch MRS [43]. - Phương pháp xác định khả năng phân giải CaCO3 của vi khuẩn malolactic: Môi trường thạch MRS có bổ sung 20g/l CaCO3 được đổ vào các đĩa pettri. Tiến hành đục lỗ trên các đĩa thạch với số lượng 3 lỗ/đĩa. Sau đó hút 30µl dịch vi khuẩn malolactic cho vào mỗi lỗ. Ủ các đĩa thạch ở nhiệt độ 37oC trong 3-5 ngày và quan sát vòng phân giải CaCO3 của vi khuẩn. - Phương pháp xác định đặc tính lên men dị hình (khả năng sinh CO2) bằng ống Dulham theo Collin, 1989 [15]. Trong môi trường lên men MRS có chứa glucoza trong ống nghiệm 10ml có chứa ống Dulham ở dưới đáy của ống nghiệm được cấy giống vi khuẩn lactic. Chủng nào sinh khí CO2 sau 24 - 48h sẽ tạo ra áp xuất đẩy ống thử dulham lên phía trên bề mặt môi trường trong ống nghiệm. Qua đó xác định được các chủng lên men di hình. Chủng nào không sinh khí sẽ không đẩy được ống thử Dulham lên phía trên bề mặt môi trường trong ống nghiệm. 2.2.3 Phương pháp phân tích lý hóa
30 ml mẫu được được lấy ra cho vào cốc mẫu. Giá trị pH được xác định trực tiếp bằng pH metter (Máy đo pH 315i/SET, Đức).
Độ đục của mẫu được xác định bằng máy đo độ đục Turbidity (Italy). - Phương pháp đo tỷ trọng: Tỷ trọng của dung dịch được xác định bằng thước đo tỷ trọng ở 200C. - Xác định axít bay hơi. Axít bay hơi được xác định bằng phương pháp của Zoecklein và cs (1989) [48]. 10 ml mẫu được cho vào bình Sellier. Sau khi cất, 100ml dung dịch chưng cất được chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N. Axít bay hơi được tính theo công thức sau đây: Axít bay hơi (g axít axetic/l) = [ml NaOH x N x 0,06)/V] x 100 Trong đó: N: nồng độ của NaOH , V: thể tích mẫu (ml).
Axít tổng số được xác định theo phương pháp của Zoecklein (1989). 10 mL mẫu được đun sôi trong 30 giây để loại bỏ C02. Sau đó 90 ml nước cất được thêm vào và sau đó chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N. Axít tổng số được tính theo công thức sau: Axít tổng số (g axít tactaric/L) =[(mL NaOH X N X 0,075)/V] X 1000
Etanol được xác định bằng phương pháp cất trên thiết bị Distiller System (Đức), sau đó xác định độ cồn bằng alcohol metter.
Hàm lượng axit L-malic được đo bằng phương pháp kít chuẩn enzym (BOEHRINGER MANNHEIN, Cat.No.10139068035). - Phương pháp xác định SO2 tự do và SO2 tổng số [20]. - Phương pháp xác định diaxetyl: theo AOAC (1995) [9]. - Phương pháp phân tích các chất thơm furfural, cis-lacton, trans-lacton và anillin: bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) [21]. - Xác định hàm lượng cồn theo TCVN 378:1986. Etanol được xác định bằng phương pháp cất trên thiết bị Distiller của Merck, sau đó xác định độ cồn bằng alcohol metter. - Xác định hàm lượng axít L-malic, L-lactic và axít axetic bằng phương pháp kit chuẩn enzim (Boehringer Mánnhein, Đức). CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn malolactic cho sản xuất rượu vang
Các vi khuẩn có khả năng phân giải axít malic trong rượu vang được gọi là vi khuẩn malolactic. Để phân lập được các chủng malolactic này, trước hết phải tiến hành phân lập sơ bộ có định hướng (vi khuẩn gram dương, catalaza âm tính, khả năng phân giải CaCO3,...) để thu nhận được các chủng vi khuẩn lactic, rồi tiếp theo xác định khả năng lên men malolactic của các chủng nhằm tìm ra chủng có đặc tính công nghệ phù hợp nhất cho lên men malolactic rượu vang đỏ. Phân lập sơ bộ các chủng vi khuẩn lactic và có định hướng lên men malolactic từ lá và quả nho tại Ninh Thuận, kết quả được trình bày ở bảng 3.1 Bảng 3.1. Đặc tính sinh lý của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được
Каталог: files -> ChuaChuyenDoi ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05 ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường tải về 0.69 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||