Phân loại vi sinh bằng Sinh Học Phân Tử
+ Kỹ thuật dấu vân tay (finger printing) phân tích plasmid với enzym cắt hạn chế
tải về 0.72 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- + Kỹ thuật điện di trong trường xung điện (điện di trong trường điện thay đổi, PFGE )
+ Kỹ thuật dấu vân tay (finger printing) phân tích plasmid với enzym cắt hạn chế:Cho đến nay, người ta đã tìm thấy hơn 400 enzym cắt hạn chế. Mục đích của kỹ thuật này bổ sung cho kỹ thuật so sánh phổ kích thước plasmid ở trên. Tức là người ta có thể phân biệt được sự khác nhau của các plasmid có cùng kích thước. Như vậy, khi xử lý plasmid với một hay kết hợp một số enzym cắt hạn chế thì kết quả sẽ thu được là các đoạn ADN được cắt có kích thước khác nhau. Kết quả này có độ lặp lại cao, do đó dễ sử dụng khi so sánh các mẫu khác nhau. Hiện nay, có nhiều enzym cắt hạn chế được sản xuất và tiêu thụ trên thị trường, các enzym này có điểm nhận biết thay đổi từ 4-6 cặp nucleotid. Thông thường xử lý enzym trong 1 giờ sau đó mẫu được phát hiện trên gel agarose hoặc polyacrylamid Tuỳ thuộc vào kích thước của các mảnh cắt mà sử dụng agarose có nồng độ khác nhau: Bảng 1.1. Nồng độ agarose và kích thước mẫu ADN tương ứng.
Theo kinh nghiệm của nhiều tác giả (Grimont-1991) phổ các băng ADN có ý nghĩa cho so sánh không nên dưới 10 băng và nên có cả băng kích thước nhỏ và kích thước lớn. Tuy nhiên, các băng lớn không nên vượt quá 10 do băng có kích thước lớn như vậy khó di chuyển trên gel. Trong các trường hợp so sánh thì nên dùng thang chuẩn ADN để so sánh kích thước và phép phân tích dấu vân tay cho các lần phân tích khác nhau. Như đã trình bày ở trên, nếu như phân tích các chủng vi sinh vật dựa vào kích thước plasmid có ý nghĩa đối với các đối tượng có nhiều plasmid thì phương pháp xử lý enzym cắt hạn chế lại có ý nghĩa lớn trong các trường hợp nghiên cứu dịch tễ học trên các chủng có cùng phổ plasmid hay plasmid có kích thước giống nhau. Người ta đã ứng dụng kỹ thuật này trong nghiên cứu chủng E.coli (0157: H7) gây bệnh từ thực phẩm (Hamburger). Các plasmid từ các chủng khác nhau thì có phổ khác nhau về các đặc điểm cắt bởi enzym cắt hạn chế. Kết quả tạo ra các mảnh ADN đặc trưng cho cá thể làm cơ sở cho phép so sánh. Tuy nhiên khó có thể so sánh kết quả thu được từ các phòng thí nghiệm khác nhau, sở dĩ như vậy là do không dùng cùng một loại enzym cắt hạn chế. Một lý do nữa cũng cần được đề cập đến là sự xuất hiện các đột biến ngẫu nhiên tại vị trí enzym cắt, kết quả này tạo ra sự khác biệt về phổ thu được từ các mảnh cắt. b. Phân tích ADN nhiễm sắc thể:Phương pháp phân tích ở đây bao gồm việc tách ADN của nhiễm sắc thể và cắt bằng enzym cắt hạn chế để phân biệt giữa các vi sinh vật với nhau. Một chú ý khi tách ADN nhiễm sắc thể phải thao tác nhẹ nhàng để tránh đứt gãy do nguyên nhân cơ học. Nói chung các mảnh cắt nên có kích thước nhỏ hơn hoặc bằng 50 kb. Việc tách các mảnh cắt đó được thực hiện dựa vào kỹ thuật điện di trong trường xung điện (PFGE = Pulsed Field Gel Electrophoresis ).> Như vậy kỹ thuật dấu vân tay không chỉ áp dụng trong trường hợp trên tế bào mang plasmid mà kỹ thuật này còn được sử dụng với nhiễm sắc thể cho mọi trường hợp.rường hợp.ường hợp.ường hợp. Liên quan đến vấn đề này phải kể đến kỹ thuật BRENDA: phân tích kết quả xử lý enzym cắt hạn chế với vi sinh vật. Ở đây cách chọn loại enzym cắt hạn chế vô cùng quan trọng, theo cách chọn này có thể tạo ra quá nhiều mảnh cắt nên không thể phân biệt được các băng riêng rẽ trong khi đó đối với các trường hợp khác lại tạo ra quá ít mảnh cắt có kích thước lớn khó tách theo các kỹ thuật điện di hiện có. Các vi sinh vật khác nhau có tỷ lệ GC khác nhau (dao động từ 25-75%) các mảnh cắt thu được sau khi xử lý enzym cắt hạn chế rất khác nhau. Theo Nei M. và Li W. H. (1979) thì số mảnh cắt có thể thu được tính trên lý thuyết là: a = (g/2)r1 x {1-(g/2)}r2Trong đó: g - tỷ lệ GC của ADN r1 - số cặp GC r2 - số cặp AT trong vị trí cắt của enzym giới hạn sử dụng a - số vị trí cắt khi sử dụng enzym cắt hạn chế. Mặt khác, người ta cũng căn cứ vào kết quả nghiên cứu các vị trí cắt của bộ gene vi sinh vật làm cơ sở cho cách chọn enzym cắt. Thông thường cho mỗi phép phân tích người ta ghi được số các băng cắt bởi enzym và tính toán kích thước các mảnh tạo thành làm cơ sở cho các phép phân tích về sau. Tuy nhiên, một trong những nguyên nhân hạn chế cho phép phân tích trên là các phương pháp tách ADN thông thường đều dẫn đến thay đổi kích thước do đứt gãy ADN nhiễm sắc thể, mặt khác sự có mặt của plasmid lẫn cũng tạo ra sự khác biệt giả trong kết quả phân tích, để khắc phục nhược điểm trên người ta phải thực hiện phép phân tích ADN nhiễm sắc thể nguyên vẹn để phát hiện các nguồn ADN tạp nhiễm lẫn vào kết quả phân tích. + Kỹ thuật điện di trong trường xung điện (điện di trong trường điện thay đổi, PFGE)- Nguyên tắc: Trước tiên các mẫu đưa vào phân tích phải được xử lý trước bằng loại enzym cắt hạn chế mà có rất ít điểm cắt. Kết quả phải tạo ra được các mảnh có kích thước lớn (50 kb – 12 Mb), với kích thước này không thể điện di theo phương pháp thông thường mà chỉ có thể tách ra bằng kỹ thuật PFGE (ật PFGE (ật PFGE (uật PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis ). Kỹ thuật PFGE lần đầu tiên được Schwartz va Cantor (1984) giới thiệu. Tuy nhiên sau đó đã có nhiều tác giả mô tả lại kỹ thuật này, tuy có sai khác ít nhiều nhưng cơ sở lý thuyết của các phương pháp này là như nhau: Mục đích của kỹ thuật này là tăng khả năng di động của các mảnh ADN có kích thước lớn trong điện trường, do đó các thành phần gel và đệm hầu như không thay đổi theo các phương pháp điện di thông thường. Tuy nhiên theo phương pháp thông thường thì sự điện di liên quan đến sự di động của các mảnh ADN có kích thước khác nhau trên gel agarose trong một trường điện không đổi. Kết quả ở đây là phân tử lớn khó di động hơn phân tử nhỏ qua mắt xích agarose, tạo ra sự tách biệt trong trường điện di. Trong trường hợp PFGE lực làm thay đổi khả năng di động lại là trường điện tích thay đổi liên tục dẫn đến các mảnh ADN có kích thước khác nhau thay đổi hướng di động. Như vậy kết quả là các mảnh có kích thước khác nhau sẽ có khả năng di động khác nhau. Kích thước càng lớn thì mức độ di động càng chậm. Sự di động khác nhau của ADN chủ yếu phụ thuộc vào kích thước chứ không phải do gel agarose như ở phương pháp điện di thông thường, hình 1.2. 
Hình 1.2. Sử dụng kỹ thuật PFGE phân tích nhiễm sắc thể sau khi xử lý với Sma I với 7 chủng Haemophilus ìnluenzae. Tiếp theo các mô tả của Schwartz va Cantor, Smith và Codemine (1990) đã đề cập đến sự di chuyển của các mảnh ADN khác nhau là hàm số tuyến tính với kích thước của chúng. Trên cơ sở đó có thể điều chỉnh các xung điện và điện trường. Tuy nhiên các nhân tố khác cũng có mối tương tác lẫn nhau và ảnh hưởng đến khả năng di động của ADN như: nhiệt độ, điện thế, nồng độ agarose cũng như nồng độ ion trong đệm. - Chuẩn bị ADN cho PFGE: Chuẩn bị ADN từ nhiễm sắc thể không giống như các phương pháp chuẩn bị ADN plasmid. Một vấn đề thường xảy ra là sự đứt gãy ngẫu nhiên ADN dẫn đến sai khác trong kết quả phân tích. Để hạn chế điều này người ta phải thực hiện kỹ thuật tách ADN NST khỏi tế bào mẫu agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp – LMT (Schwartz va Cantor – 1984 và Smith, Klco 1988). Theo phương pháp này hỗn dịch tế bào (dịch nuôi cấy hoặc dịch huyền phù) được trộn với LMT agarose tại 37oC. Hỗn dịch đầu tiên được xử lý với enzym và chất tẩy rửa để tách ADN NST khỏi thành, màng tế bào, RNA và protein. Sau đó là xử lý với EDTA, bất hoạt nuclease tế bào với proteinase K và N-lauroylsarcosine để loại các thành phần khác của tế bào. Kết quả là phần LMT agarose có chứa ADN NST được dùng làm mẫu chạy gel 0.5-1.0% (nên làm tan ở 65oC) và đưa lên mẫu chạy gel PFGE, tài liệu của Smith (1988) mô tả chi tiết cách chuẩn bị mẫu từ các tế bào có và không có thành tế bào: vi khuẩn, nấm men, nấm sợi, tế bào thực vật và động vật. Nói chung với các trường hợp có thành tế bào thì cần đến enzym phá thành tế bào. Lượng ADN NST thường dao động trong khoảng 0.5-20 µg ADN là thích hợp. Nếu quá nhiều ADN thì không thể phân tích được, còn quá ít thì cũng không thể phát hiện được các băng ADN trong kết quả phân tích. Mẫu ADN dùng cho kỹ thuật PFGE có thể được giữ 1 năm trong lạnh có chứa 0.5M EDTA. - Sau khi thu được ADN NST trong mẫu LMT agarose thì tiến hành xử lý với enzym giới hạn loại có ít điểm cắt. Tuy nhiên mẫu đầu tiên phải được xử lý với PMSF để bất hoạt protein K sau đó PMSF lại phải loại bỏ sau một số lần rửa với chất tẩy rửa và EDTA. Sau đó chỉ cần phân nhỏ mẫu trong agarose được xử lý với đệm và enzym cắt hạn chế qua đêm trong tube và sau đó toàn bộ mẫu này được sử dụng để tách trong trường xung điện. Bảng 1.2 dưới đây liệt kê các enzym cắt hạn chế được dùng cho phân tích PFGE. Bảng 1.2. Một số enzym cắt hạn chế được dùng cho kỹ thuật PFGE.
Каталог: 2015 2015 -> CHỦ TỊch nưỚC 2015 -> CHỦ TỊch nưỚC 2015 -> Qcvn 81: 2014/bgtvt 2015 -> Tác giả phạm hồng thái bài giảng ngôn ngữ LẬp trình c/C++ 2015 -> TRƯỜng đẠi học ngân hàng tp. Hcm markerting cơ BẢn lớP: mk001-1-111-T01 2015 -> Bch đOÀn tỉnh thanh hóa số: 381 bc/TĐtn-btg đOÀn tncs hồ chí minh 2015 -> Hãy là người đầu tiên biết 2015 -> Có chiến lược toàn diện về việc truyền phát tin tức 2015 -> Transformations 2015 -> SỞ gd&Đt bắc ninh trưỜng thpt hàn thuyêN tải về 0.72 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|