-               Ứng dụng của kỹ thuật phân tích PFGE

-               Ứng dụng của kỹ thuật phân tích PFGE:

Kỹ thuật PFGE đã được sử dụng cho nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau (xem bảng 1.3).

Vi sinh vật nghiên cứu

Tài liệu tham khảo

1.      Acinetobacter baumannii 2.      Brucella spp 3.      Campylobacter hyointestinalis 4.      Campylobacter jejuni 5.      CADNida arabicans 6.      CADNida prapsilosis 7.      Coxiella burnettii 8.      Enterobacter cloacae 9.      Enterococcus faecium 10. Escherichia coli 11. Listeria monocytogenees 12. Leptospira spp 13. Mycobacterium tuberculosis 14. Neisseria meningitidis 15. Psedomonas aeruginosa 16. Shigella spp 17. Staphylococcus aureus 18. Streptococci ssp

Gouby et al (1992) Allardet, Servent et al (19980 Salama et al (1992) Yan et al (1991) Vasquez et al (1991) Carruba et al (1991) Heizen et al (1990) Haertl ADN BADNlow (1993) MirADNa et al (1991) Bohm ADN Karch (1992) Brosch et al (1991) Herrmann et al (1992) Zhang et al (1992) Bygraves ADN Maiden (1992) Boukadida et al (1987) Sodati ADN Piffaretti (1991) Prevost et al (1992) Single ADN Martin (1992)

Mỗi một đối tượng có đặc trưng riêng về kết quả phân tích PFGE và được dùng cho nghiên cứu so sánh với nhau về sự tương đồng. Đối với nhiều đối tượng có nhiễm sắc thể thì không nhất thiết phải thực hiện đối với mọi nhiễm sắc thể mà chỉ cần trên một số nhiễm sắc thể mà thôi. Ví dụ trong trường hợp của C.albicans Monod (1990) chỉ cần thực hiện phép phân tích với một trong 4 tổ hợp của một số nhiễm sắc thể là đủ. Cho dù theo các cách chuẩn bị nhiễm sắc thể khác nhau thì kết quả của phép phân tích PFGE đều giống nhau. Phép phân tích PFGE được ứng dụng cho các nghiên cứu ở mức độ loài với loài.

         Một số điểm cần lưu ý khi sử dụng kỹ thuật PFGE:

         + Kỹ thuật này đòi hỏi phải có trang thiết bị chuyên dụng, kỹ thuật cũng như kinh nghiệm vì việc tách nhiễm sắc thể đôi khi gặp khó khăn trên một số đối tượng vi sinh vật.

         + Kỹ thuật PFGE không đủ nhạy để phát hiện những sai khác nhỏ giữa các mẫu, đặc biệt khi thực hiện với một enzym thì kết quả có thể giống nhau nhưng không chắc chắn là hai mẫu giống nhau hoàn toàn. Điều đó có nghĩa là kỹ thuật này nên dùng để xác định sự khác nhau còn việc xác định sự giống nhau thì không đủ tin cậy. Tuy nhiên ngay cả khi xác định sự khác nhau đôi khi các mẫu có plasmid nhỏ hay thực khuẩn thể cũng cần xét đến vì chính nguồn ADN này cũng tạo ra những sai khác giả.

         + Sự khác biệt giữa các mẫu có thể phát hiện được khi dùng các enzym cắt hạn chế khác nhau.

Tóm tắt:

         Phương pháp phân tích plasmid là phương pháp được dùng phổ biến trong các phòng thí nghiệm chuẩn đoán vi sinh vật. Việc kết hợp giữa phân tích plasmid với sử dụng enzym cắt hạn chế sẽ tạo được sự phân tích chính xác với các thông tin đáng tin cậy đối với các mẫu phân tích. Tuy nhiên, khi phân tích các mẫu dựa trên plasmid thì cần lưu ý là các plasmid có thể bị mất qua các thế hệ phân chia, dẫn đến sai lệch các kết quả nghiên cứu. Khi thực hiện phép phân tích PFGE với các plasmid lớn sẽ khắc phục được hạn chế của các phép phân tích hiện tại với plasmid nhỏ như trên. Phương pháp PFGE hiện đang được dùng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm vi sinh vật, áp dụng trên các đối tượng dễ nuôi cấy có thể cho các kết quả tốt hơn nhưng hạn chế về giá thành thiết bị cũng như yêu cầu cao về kỹ thuật và kinh nghiệm. Mặt khác khi sử dụng các enzym cắt hạn chế hiếm có thể sẽ khó phát hiện được mức độ sai khác. Như vậy sự kết hợp giữa các phép phân tích plasmid, PFGE và lai ADN sẽ cho kết quả tin cậy hơn.

2.2. Lai ADN

Nguyên tắc được tiến hành như sau: ADN tổng số được tách ra và xử lý với enzym cắt hạn chế (có trường hợp không cần xử lý với enzym cắt hạn chế) sau đó điện di trên gel agarose và chuyển lên màng lai. Mẫu dò (probe) được chuẩn bị và lai với màng ADN ở trên. Kết quả phép lai cho biết sự khác biệt giữa các mẫu ADN khác nhau.

         Phép lai được tiến hành ở đây dựa vào cấu trúc sợi đôi ADN từ hai sợi đơn với các cầu liên kết hydrogene theo nguyên tắc bổ sung. Bắt đầu là đứt gãy các liên kết hydrogene do hoá chất (kiềm) hay biến tính nhiệt, lúc này hai sợi đơn ADN tách nhau  được gọi là trạng thái biến tính ADN (denature). Nếu tại thời điểm này người ta cho vào một ADN đánh dấu biến tính (mẫu dò) sau đó tạo điều kiện hồi biến xuất hiện (renature), lúc đó sẽ cho phép các sợi đơn của mẫu dò bắt cặp với các sợi đơn của mẫu ADN ban đầu (target ADN). Mức độ lai sẽ phụ thuộc vào tính đặc hiệu (sự tương đồng) giữa mẫu dò và mẫu gốc cũng như điều kiện cho phép lai thực hiện (nhiệt độ, nồng độ muối, pH, tỷ lện mẫu dò, kích thước mẫu dò). Như vậy, việc chọn điều kiện chính xác cho phép lai có ý nghĩa rất quan trọng cho tính đặc hiệu của kết quả phép lai. Sau khi lai, bước tiếp theo là rửa bằng đệm thích hợp để loại mẫu dò dư và cuối cùng là phép đo bức xạ đánh dấu (tuỳ theo phương pháp đánh dấu phóng xạ hay hoá chất phát xạ huỳnh quang) để đánh giá mức độ tương đồng của phép lai.

         Nói tóm lại một số nhân tố tham gia vào kết quả của phép lai là: mẫu dò ADN, phương pháp đánh dấu ADN, mẫu ADN lai và điều kiện tiến hành và phương pháp đánh giá kết quả phép lai.

         + Chọn mẫu dò:

         Việc chọn mẫu dò có ý nghĩa quan trọng cho phép lai. Nhìn chung các nhà phân loại học vi sinh vật thường không trực tiếp thiết kế mẫu dò. Về mặt này chúng tôi đưa ra một số nội dung chủ yếu về tiêu chí chọn mẫu dò theo Stahl và Amann (1991) như sau: Mẫu dò sẽ lai với ADN đích (target) và không lai với các nguồn ADN khác có mặt trong mẫu lai. Khi phân tích các mẫu vi sinh vật với nhau thì mẫu dò nên là đoạn nucleotid đặc trưng cho các mẫu phân tích để phân biệt với các sinh vật khác. Tuy việc chọn mẫu dò cũng mang tính kinh nghiệm, mẫu dò đôi khi không cần phải là toàn bộ gene mà chỉ là một đoạn gene mã hoá cho một đặc tính đặc trưng cho đối tượng nghiên cứu (có thể là yếu tố kháng nguyên bề mặt, độc tố hay một gene chức năng nào đó trên plasmid). Với cách chọn mẫu dò có kích thước nhỏ (14-40 bp), có thuận lợi là các mẫu dò được tổng hợp nhân tạo và phép lai thực hiện nhanh (dưới 30 phút) trong khi đó với các mẫu dò lớn thời gian kéo dài hơn (khoảng 16 giờ). Hạn chế lớn nhất đối với các mẫu dò nhỏ là khó khăn khi đánh dấu và dẫn đến giảm tính đặc hiệu của phép lai.

         Một cách thường được sử dụng là thiết kế các mẫu dò từ các chuỗi ARN thông tin 16S. Cách chọn có thể căn cứ vào đoạn ADN có mặt trong các đại diện mức độ dưới loài, trong loài hay thuộc chi nghiên cứu.

         + Các phương pháp đánh dấu:

         Các kỹ thuật đánh dấu ADN được xem là lĩnh vực phát triển mạnh nhất trong sinh học phân tử. Nói chung kỹ thuật đánh dấu được chia thành kỹ thuật đánh dấu trực tiếp và gián tiếp. Trong phương pháp trực tiếp thì phần đánh dấu để phát hiện được gắn vào acid nucleic. Đối với phương pháp gián tiếp thì có một phần chức năng được gắn vào acid nucleic và phần này lại được phát hiện gián tiếp dựa vào protein bám đặc hiệu được phát hiện bằng kỹ thuật miễn dịch. Sau đây là chi tiết các phương pháp đánh dấu.

·        Đánh dấu trực tiếp:

- Bảng dưới đây đưa ra các loại cơ chất dùng cho phương pháp đánh dấu trực tiếp dựa vào việc nhân ADN được đánh dấu lên sẽ tăng độ nhạy so với phương pháp đánh dấu chỉ được thực hiện với các mồi đơn lẻ. Đối với các phương pháp đánh dấu trực tiếp thì các nhóm tạo tín hiệu được gắn trực tiếp bằng liên kết hoá trị với nucleic của mẫu dò.

- Đánh dấu trực tiếp bao gồm 2 bước chính: tạo tín hiệu dựa vào liên kết hoá trị của nhóm tín hiệu với mẫu dò và thực hiện phép lai giữa mẫu nghiên cứu và mẫu dò.

Bảng 1.4. Một số cơ chất dùng cho đánh dấu trực tiếp.

 

Nguồn tạo tín hiệu	Tài liệu
32 P 35S Alkaline phophatase Ethidium Fluorescein Horseradish peroxidase Microperoxidase Nitrobenzofuran Tetramethylorhodamine	Southern (1975) Collins& Hunsaker (1985) Renz&Kurz (1984) Albarella & ADNerson(1986) Amman & ctv (1988) Urdea ctv(1988) Heller& Shneider(1983) Draper (1984) Amman&ctv(1990)

 



Hình 1.3. Minh hoạ phương pháp đánh dấu trực tiếp (A) và gián tiếp (B)

 

Каталог: 2015
2015 -> CHỦ TỊch nưỚC
2015 -> CHỦ TỊch nưỚC
2015 -> Qcvn 81: 2014/bgtvt
2015 -> Tác giả phạm hồng thái bài giảng ngôn ngữ LẬp trình c/C++
2015 -> TRƯỜng đẠi học ngân hàng tp. Hcm markerting cơ BẢn lớP: mk001-1-111-T01
2015 -> Bch đOÀn tỉnh thanh hóa số: 381 bc/TĐtn-btg đOÀn tncs hồ chí minh
2015 -> Hãy là người đầu tiên biết
2015 -> Có chiến lược toàn diện về việc truyền phát tin tức
2015 -> Transformations
2015 -> SỞ gd&Đt bắc ninh trưỜng thpt hàn thuyêN

tải về 0.72 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn: