Hóa chất và cách chuẩn bị

     Hóa chất và cách chuẩn bị:

         Phương pháp này thích ứng với việc giải trình tự các plasmid sợi đôi. Bắt đầu bằng việc gây biến tính trong kiềm (NaOH) hoặc glycerol, sau đó kết tủa ADN và bắt cặp với ADN mồi dùng để giải trình tự. Phương pháp giải trình tự ADN với sợi đôi cần lượng ADN mồi cao gấp 10-20 lần so với sợi đơn. Việc giải trình tự gồm hai phản ứng: phản ứng đánh dấu và phản ứng dừng tại điểm cuối. Trong phản ứng đánh dấu các sợi ADN bổ sung được gắn kết với chất đánh dấu phóng xạ trong việc kéo dài chuỗi. Sau đó phản ứng kéo dài chuỗi ADN bị dừng một cách ngẫu nhiên do nồng độ thấp của nucleotid trong dịch phản ứng (0.08 mM). Bước tiếp theo là kết thúc chỗi với dideoxynucleotid khi có nồng độ cao của deoxyribonucleotid (33,3 mM). Các trình tự tiếp theo của sợi khuôn sẽ được xác định với nồng độ cao của deoxynucleotid trong khi phản ứng đánh dấu xảy ra trước việc bổ sung dideoxynucleotid vào hỗn hợp phản ứng. Quy trình sau đây đã được rút gọn, có nhiều phần tiện ích chi tiết hơn và thay đổi trong các tài liệu hướng dẫn.

      Điều quan trọng để có kết quả tốt trong việc giải trình tự ADN là chất lượng cao của ADN plasmid. Trong các khâu chuẩn bị việc xuất hiện các phân tử đứt gãy sẽ dẫn đến kết quả không rõ, khó xác định các băng. Các plasmid sợi đơn phải được làm biến tính cho mở xoắn trước khi giải trình tự. Biến tính các plasmid xoắn do liên kết hóa trị không phải lúc nào cũng đạt được bằng xử lý nhiệt tại nhiệt độ bắt cặp mồi hay trong đệm phản ứng, bởi lẽ nhiệt độ mở xoắn thường là 105ng là 105^oC. Có hai phương pháp khá nhanh và tiện lợi: Một phương pháp xuất phát từ thực tế là glycerol hoặc ethylen glycerol có tác dụng làm giảm nhiệt độ mở xoắn, còn phương pháp thứ 2 là mở xoắn bằng môi trường kiềm. Cả hai phương pháp đều thực hiện đơn giản cho hầu hết các loại ADN khuôn.

Đối với hai phương pháp biến tính ADN, nên dùng lượng ADN khuôn ở nồng độ 0.5 pmol (05- 0.3 mg) và lượng primer 2-5 pmpol. Nếu sử dụng thể tích ADN nhỏ hơn thì phải pha đến nồng độ thích hợp bằng nước. Kết quả tốt nhất thu được là theo tỷ lệ phân tử mồi : sợi khuôn là 4 : 1. Tỷ lệ này nên được duy trì khi tiến hành với lượng ADN khuôn khác nhau. Trong mọi trường hợp khi mà số lượng thành phần nào quá ít thì đều dẫn đến băng không rõ ở cuối bản gel. Lượng ADN khuôn cần theo phương pháp này ít hơn so với sử dụng sequenase KIT 2.0 do không bị mất ADN trong bước kết tủa với ethanol. Tác nhân gây biến tính ADN khuôn trong KIT này là đệm 40:50 glycerol và ethylen glycerol. Việc bổ sung đệm này vào dung dịch ADN theo tỷ lệ chỉ dẫn; 40% glycerol sẽ làm giảm nhiệt độ biến tính ADN xuống khoảng 20^oC. Chý ý khi dùng đệm glycerol sẽ gây nên việc di chuyển không đều trên gel điện di tại vùng có khoảng cách 300-400 kể từ đoạn ADN mồi. Nên sử dụng đệm chạy gel hạn chế tác dụng của glycerol (thay taurin cho đệm chạy gel TBE) sẽ khắc phục được điều này.

ADN plasmid sẽ biến tính tại bất kỳ nhiệt độ nào ở pH kiềm (pH 13). Điều quan trọng đối với phương pháp này là việc trung hòa bước biến tính kiềm bằng HCL phải được thực hiện một cách chính xác. Như vậy nên dùng một loại pipet cho việc bổ sung kiềm và trung hòa bằng acid HCL sau đó. Nói chung dung dịch NaOH và HCL được chuẩn bị có nồng độ 1M, trong trường hợp dùng hóa chất riêng phải đảm bảo nồng độ chỉ dao động trong khoảng 0,95- 1.05M. Bước gây biến tính kiềm và kết tủa với ethanol cũng có thể được thực hiện với các hóa chất trong KIT nhưng đôi khi cũng không đạt được kết quả mong muốn và cần phải cải tiến.

Trong trường hợp giải trình tự với ADN sợi đơn, không phải thực hiện bước biến tính ADN, hỗn dịch được chuẩn bị đơn giản gồm: ADN plasmid, 05 pmol primer, 2 ml đệm phản ứng và bổ sung nước cho đủ 15 ml.

Phản ứng tốt sẽ đọc được trình tự dài khoảng 400 bps.

Cách tiến hành cụ thể:

1.     Biến tính ADN (theo hai cách trình bày ở trên).

A.   Biến tính với glycerol:

Đệm biến tính plasmid:    5 ml.

Primer:                             1 ml.

Nước cất dẫn đến:            13 ml.                

Trộn đều, ủ trong 5 phút ở 90 – 100 ^oC, làm lạnh nhanh trên đá.

Bổ sung thêm đệm phản ứng: 2 ml để đạt được tổng thể tích là 15 ml.

                        B. Biến tính với kiềm (không cần kết tủa với ethanol).

     Thành phần phản ứng gồm:

         ADN:                    0.5 - 3mg  (thể tích tối đa là 8ml)

         NaOH 1M:            2 ml.

         Primer:                  1 ml.

         Nước cất dẫn đến: 11 ml.

              Trộn đều, giữ trong 10 phút tại 37^oC, làm lạnh nhanh trên đá.

Điều quan trọng trong phương pháp này là bước trung hòa phải được thực hiện chính xác với HCL.

              Sau đó bổ sung HCL 1M : 2 ml.

              Đệm phản ứng plasmid:     2 ml.

              Tổng thể tích là:                15 ml.

2.     Bắt cặp mồi vào sợi khuôn:

Giữ hỗn dịch ADN và mồi ở 37^oC trong 10 phút, sau đó giữ trên đá lạnh (mẫu chỉ nên dùng trong vòng 4 giờ).

3.     Chuẩn bị tube chứa hỗn dịch kết thúc chuỗi:

Trong khi thực hiện bước bắt cặp sợi khuôn và sợi mồi, tiến thành hút 2,5 ml hỗn dịch kết thúc chuỗi cho từng loại (ddA, ddC, ddG, ddT) cho vào từng tube riêng biệt. Đậy nắp, để trên đá để dùng cho các bước 5 và 7.

         4. Pha loãng dịch đánh dấu:

Pha loãng dịch đánh dấu 5 lần với nước và giữ trên đá. Không nên pha loãng dịch đánh dấu khi muốn đọc đoạn ở xa mồi.

                  Dịch đánh dấu: 2 ml

                  Nước:               8 ml

                  Tổng số:           10 ml.

5. Làm ấm các mẫu đá chuẩn bị trong bước 3:

Bốn mẫu được chuẩn bị trong bước 3 lần lượt là ACGT được ủ ở 37^oC trong 1 phút.

6. Phản ứng đánh dấu (kể từ bước này thì mọi đầu côn và pipét sẽ thực hiện với hóa chất phóng xạ, do đó cần phải có các biện pháp bảo vệ và đeo găng tay).

Bổ sung lần lượt các thành phần sau vào 15 ml hỗn dịch bắt cặp đã được chuẩn bị trong bước 1.

         DTT 0.1M :                                         1 ml

         Dịch đánh dấu (bước 4):                     2 ml

         Hóa chất phóng xạ: S³⁵ (P³³, P³²):       0.5 ml

         Enzym T7 sequenase cho plasmid:      2 ml

         Tổng thể tích :                                  20.5 ml

    (Thể tích này sẽ được chia ra 4 phần trong bước 7)

Trộn đều (tránh bọt), ủ hỗn dịch tại nhiệt độ phòng 2 -5 phút (đối với plasmid làm biến tính trong glycerol thì ủ 5-10 phút tại nhiệt độ phòng hoặc 5 phút tại 37^oC). Thường bổ sung hỗn dịch T7 sequenase cho plasmid cuối cùng, sau khi các thành phần khác đã được bổ sung. Không bao giờ bổ sung hỗn dịch T7 sequenase cho plasmid vào hỗn dịch đánh dấu, DTT hay hỗn dịch khác không phải là đệm.

Chú ý: Nếu trong trường hợp chất phóng xạ S³⁵ để quá lâu thì có thể tăng lượng lên 2 ml cho mỗi phản ứng, sau đó giảm lượng nước tương ứng.

7. Phản ứng kết thúc chuỗi:

a. Lấy 4,5 ml hỗn dịch thu được từ bước 6 cho vào thành trên của 4 tube kết thúc chuỗi đã được làm ấm ở bước 5 (A, C, G, T). Đậy nắp lại và li tâm nhanh để trộn đều, tiếp tục ủ trong 5 phút tại 37^oC (có thể kéo dài tới 30 phút). Nếu thấy cần thiết thì có thể li tâm nhanh để thu lấy hỗn dịch trước khi tiến hành phản ứng đánh dấu.

b. Tại thời điểm cuối của 5 phút, bổ sung 4 ml hỗn dịch dừng phản ứng vào thành trên của các tube và đóng nắp nhanh. Như vậy có thể dừng phản ứng tại thời gian thích hợp bằng cách li tâm để dịch dừng phản ứng đi xuống hỗn dịch phản ứng.

c. Ngay lập tức li tâm để dịch dừng phản ứng đi xuống hỗn dịch phản ứng, sau bước này phản ứng đánh dấu đã hoàn tất và mẫu có thể được giữ ở 4 ^oC để sử dụng trong ngày hôm sau.

d. Xử lý ở nhiệt độ 75^oC cho các mẫu khoảng 2-3 phút ngay trước khi tra mẫu lên gel, với các mẫu chứa glycerol thì việc lên mẫu dễ dàng với đầu côn vàng.

e. Lên khoảng 2-3 ml mẫu cho mỗi giếng trên gel giải trình tự. Nên đưa một lượng đồng mẫu trên các giếng. Cách tốt nhất để lên mẫu không bị bọt là hút 3 ml mẫu nhưng khi tra chỉ dùng 2 ml là đủ.

Hỗn dịch kết thúc chuỗi:

                   95% Formamide

                   20mM EDTA (Na2), pH 8.0

                   0.05% Bromopheno Blue (BPB).

                   0.5% Xylen CyanolFF (XC).

         Chú ý, nếu bạn gặp trục trặc với việc giải trình tự ADN thì các plasmid nên được tái tinh sạch với Genee-Clean hoặc sắc ký trao đổi ion.

Các phần dưới đây đề cập đến một số vấn đề nảy sinh và cách giải quyết khi tiến hành giải trình tự ADN.

- Muốn đọc được trình tự ADN dài hơn:

Yêu cầu đầu tiên là phải đọc được đoạn gene đến mức có thể trên gel. Thông thường thì kích thước đọc cho mỗi phản ứng trên gel là 250-300 nucleotid. Với thời gian chạy gel lâu khoảng 8 giờ thì có thể đọc được kích thước gene dài hơn 400 nucleotid. Nếu sử dụng gel gradient sẽ không phù hợp cho mục đích này vì khoảng cách giữa các băng ADN sẽ hẹp tới mức không thể đọc được. Nồng độ gel acrylamid dao động 4-6% là thích hợp cho kết quả tốt. Có một giải pháp nữa là có thể sử dụng gel với gradient muối nhưng vẫn giữ nguyên thời gian chạy gel (xem phương pháp 2, bước 16).

- Sự dồn các băng:

Nguyên nhân chung để không thể hoàn tất việc giải trình tự ADN là các băng không rõ do cấu trúc bậc hai trong sản phẩm của phản ứng kéo dài chuỗi, điều này thường được mô tả là sự dồn ép các băng do các băng bị thu hẹp một cách bất thường trên ảnh fim của kết quả giải trình tự ADN. Các khoảng cách hoàn toàn như nhau khi mà khoảng 3 liên kết G-C bổ sung kèm với 2-5 base có thể dẫn đến kết quả không thể đọc được đoạn gene chiếm một khoảng nhỏ trên bản gel. Khoảng trống bất thường là do ảnh hưởng của chuỗi với khoảng cách ngắn của cấu trúc bậc 2 sẽ có cùng tốc độ di chuyển như là sợi thẳng có chiều dài ngắn, tại ví trí bản fim ngoài vùng dồn băng thì khoảng cách các băng sẽ rộng khác thường do sự kém bền của cấu trúc bậc 2 làm cho chiều dài của chuỗi tăng lên và sự di động của chuỗi trở nên như bình thường.

Việc giải trình tự qua vùng gene dồn nén có thể được khắc phục bằng cách thực hiện việc đọc trình tự trên cả hai sợi. Sự bất thường về việc di chuyển nảy sinh ở các chuỗi có chiều dài không đủ cho việc bắt cặp. Điều này có nghĩa vùng gene có các băng không rõ ràng sẽ được khắc phục bằng cách sử dụng dITP thay cho dGTP trong phản ứng giải trình tự ADN. Lý do là base I chỉ có 2 liên kết với C thay vì 3 liên kết trong trường hợp với G, kết quả là ADN sẽ dễ duỗi hơn. Kỹ thuật này thường được dùng, do đó dITP có trong KIT sequenase.

Một cách khác có thể làm kém bền vùng base dồn nén do còn cặp đôi đó là thực hiện chạy gel trong điều kiện biến tính (ví dụ sử dụng formamide trong nước dùng đổ gel). Trong trường hợp này khi thay thế 25% formamide cho nước sẽ đạt được kết quả tốt nhất. Gel có formamide thường được dùng khi vùng dồn nén khá gần mồi, nên xử lý formamide qua gel trao đổi ion ngay trước khi chuẩn bị gel.

Trong các trường hợp mà các cấu trúc cặp đôi phức tạp hơn khi mà vùng dồn nén lại nằm ngay tại vị trí tương đồng trên sợi đối diện. Khi đó cách giải quyết sẽ trở nên khó khăn vì với các kỹ thuật hiện có thường đưa lại các kết quả khác nhau.

- Cường độ các băng thiếu sự đồng nhất:

Một vấn đề khác trong phản ứng giải trình tự ADN là cường độ các băng không đồng nhất. Điều này thường xuất hiện trong phương pháp giải trình tự với thiết bị tự động dựa vào phương pháp phát hiện bức xạ huỳnh quang. Sự thiếu đồng nhất là do sự có mặt của sequenase cần Mg⁺⁺ gắn dideoxy kết thúc chuỗi khác nhau tại các vị trí khác nhau (vấn đề này được bàn luận kỹ trong tài liệu USB sequenase).

b.      Kỹ thuật giải trình tự ADN trên thiết bị giải trình tự ADN tự động:

 

Hình 1.12. Thiết bị giải trình tự ADN tự độngg

            Trong phần này chúng tôi đề cập phản ứng giải trình tự ADN trên 2 loại thiết bị chủ yếu hiện đang được dùng phổ biến là: Beckman Coulter và ABI 3100-Avant