Phân loại vi sinh bằng Sinh Học Phân Tử
tải về 0.72 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- + Phương pháp enzym kết thúc phản ứng chuỗi của Sanger
- + Giới thiệu kỹ thuật giải trình tự ADN theo Sanger
- Một số điểm cần được chi tiết thêm cho mỗi bước như sau
- 2, Chuẩn bị sợi ADN mồi cho bước bắt cặp vào sợi khuôn
- 3, Thực hiện phản ứng giải trình tự ADN
- 4, Tách sản phẩm trên gel urea-acrylamid
- * Một số phương pháp cụ thể thường được dùng cho kỹ thuật giải trình tự ADN.
- + Nuôi cấy vi khuẩn mang plasmid trên môi trường chọn lọc với kháng sinh tương ứng (khoảng 3 ml).
- + Chuẩn bị ADN dùng cột Qiagene
- + Các bước dùng cột trao đổi Qiagene (tài liệu hướng dẫn sử dụng Quiagene)
- Các loại dịch đệm dùng cho cột Qiagene
- Phương pháp 2. Chuẩn bị gel cho giải trình tự ADN
b. Giải trình tự ADNPhương pháp chính xác và đưa lại nhiều thông tin nhất cho định danh và định typ vi sinh vật là xác định chính xác trình tự chuỗi ADN của một vùng quy định trên nhiễm sắc thể. Phương pháp giải trình tự ADN phát triển nhanh chóng, kết quả so sánh sự tương đồng của trình tự gene nghiên cứu trở thành phương pháp phân loại chuẩn theo sinh học phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và cây phả hệ di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu. Các gene bảo thủ được giải trình tự làm cơ sở để xác định vị trí của sinh vật nghiên cứu, trong khi đó các trình tự không tương đồng (khác biệt) lại làm cơ sở cho sự biệt hóa cũng như xác định mối quan hệ giữa các cá thể gần với nhau. + Nguyên tắc:Phương pháp giải trình tự ADN theo nguyên tắc tạo ra các mảnh ADN được đánh dấu tại đầu 5’ hoặc 3’. Các mảnh có các base đánh đấu được tách ra trên gel polyacrylamid Các mảnh được phân biệt về vị trí trên gel với sự sai khác chỉ với một nucleotid. Việc đánh dấu và đọc kết quả theo các kỹ thuật và phương pháp khác nhau. Việc tạo ra các mảnh ADN sai khác nhau về 1 nucleotid được trình bày theo 2 phương pháp: phương pháp hóa học (Maxam & Gilbert, 1997) và phương pháp enzym kết thúc phản ứng chuỗi (Sanger, 1997). Ngày nay phương pháp enzym được dùng phổ biến hơn cả. + Phương pháp enzym kết thúc phản ứng chuỗi của Sanger:Phương pháp kết thúc phản ứng chuỗi được thực hiện dựa trên việc nhân ADN từ sợi khuôn khi có đoạn ADN mồi với xúc tác của Klenow hay T7-ADN polymerase và 4 loại deoxyribonucleotid (dNTPs). Như vậy, có 4 phản ứng được tiến hành đồng thời và trong mỗi phản ứng thì có một loại dNTP bị thay đổi bởi một dẫn xuất để làm dừng phản ứng (ddNTP). Kết quả là phản ứng chuỗi bị dừng đặc hiệu cho mỗi một base xác định xảy ra một cách ngẫu nhiên trong mỗi phản ứng. Trình tự của ADN được xác định trên gel. Đầu tiên phương pháp này được xây dựng cho xác định trình tự sợi ADN đơn tạo ra bằng cách tách dòng ADN vào vectơ thực khuẩn thể M13 (Sanger và cộng sự, 1978). Sau đó phương pháp xác định trình tự sợi đôi ADN đã được Chen, William (1986) mô tả khi tách dòng ADN vào plasmid. Ngày nay người ta lựa chọn phương pháp Sanger để giải trình tự ADN cho nghiên cứu phân loại và xác định typ vi sinh vật thay cho phương pháp hóa học. Một số lợi thế của phương pháp này ở chỗ: Phương pháp này đơn giản và không tốn nhiều thời gian như phương pháp hóa học. Khi nghiên cứu phân loại và xác định typ thì các gene nghiên cứu có độ bảo thủ nhất định vì vậy ta có thể dùng chung mồi cho nhiều đối tượng khác nhau. Một trong hạn chế của phương pháp này ở chỗ các đoạn ADN cần được tách dòng trước khi tiến hành giải trình tự ADN. Tuy nhiên cho đến nay người ta đã cải tiến phương pháp này để có thể giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR. + Giới thiệu kỹ thuật giải trình tự ADN theo Sanger:Có hai phương pháp: Phương pháp giải trình tự truyền thống đọc kết quả trên bản gel (đánh dấu bằng phóng xạ là chủ yếu) và phương pháp giải trình tự và đọc kết quả tự động (đánh dấu bằng hóa chất huỳnh quang). - Phương pháp truyền thống: Các bước chính cho giải trình tự ADN như sau: Chuẩn bị ADN khuôn Bắt cặp ADN khuôn và mồi Tiến hành phản ứng giải trình tự ADN Tách sản phẩm trên gel polyacrylamid biến tính với urea. Đọc kết quả. Tuy nhiên cần chú ý một số điểm sau: 1. Chuẩn bị ADN khuôn. 2. Điều kiện bắt cặp mồi. 3. Thực hiện phản ứng giải trình tự ADN. 4. Tách sản phẩm trên acrylamid gel. 5. Đọc kết quả. Một số điểm cần được chi tiết thêm cho mỗi bước như sau:1, Chuẩn bị ADN khuôn:Sợi khuôn cần được hiểu là việc giải trình tự được thực hiện với sợi đơn (vectơ M13) hay sợi đôi ADN. Việc đọc trình tự theo sợi đơn thường cho kết quả là kích thước đoạn gene đọc dài và độ chính xác cao. Ngày nay người ta thường đọc sợi đôi vì việc chuẩn bị mẫu dễ dàng hơn, ngoài ra khi sử dụng hai phản ứng với hai mồi tương thích thì quá trình đọc lại chính xác hơn. Đó là ưu thế của cách đọc sợi đôi ADN. Do vậy, rất cần đọc kết quả từ cả hai sợi ADN. Hiện nay phương pháp đọc trình tự ADN trực tiếp từ sản phẩm PCR đang ngày càng trở lên phổ biến. 2, Chuẩn bị sợi ADN mồi cho bước bắt cặp vào sợi khuôn:Người ta có thể dùng các đoạn ADN mồi tiêu chuẩn đặc hiệu cho trình tự ADN của vectơ gần sát với sợi khuôn hay primer đặc hiệu của sợi khuôn mà nó sẽ bắt cặp vào. Tiện ích của việc dùng mồi chuẩn ở chỗ mọi điều kiện đã được lựa chọn cho sợi khuôn và mồi được dùng lặp đi lặp lại nhiều lần cho các sợi khuôn khác nhau. Hạn chế của loại mồi này ở chỗ chỉ đọc được một đoạn ngắn của gene (300 – 500 bps) trong trường hợp phải đọc các gene có kích thước lớn cần phải tiến hành subclone để đọc tiếp. Điều này có thể thực hiện bằng cách tạo ra các đoạn ADN ngẫu nhiên từ toàn bộ gene sau đó lại gắn vào vectơ để đọc cho hết trình tự của gene. Phương pháp tiếp theo là sử dụng mồi được thiết kế theo nguyên tắc bổ sung với trình tự của gene. Theo cách này, lần lượt các đoạn được đọc mà không cần thao tác subclone. Tuy nhiên theo cách đoạn mồi được thiết kế để đọc gene như vậy thì điều kiện cho từng phản ứng giải trình tự ADN với các mồi khác nhau sẽ không được tối ưu. Tuy vậy, hiện nay việc tổng hợp mồi đã trở nên dễ dàng và phổ biến với giá thành thấp, hơn thế nữa với sự trợ giúp của tin học thì bước thiết kế mồi đã được tối ưu hoá. Vì vậy phương pháp này ngày càng trở lên thông dụng hơn. Sau khi mồi đã được thiết kế thì việc tiếp theo là chọn cách đánh dấu vào mồi hay vào đoạn ADN sẽ được tổng hợp. Ưu thế của việc đánh dấu ngay tại đầu 5’ của mồi ở chỗ các băng ADN thường có cùng một cường độ tín hiệu. Thông thường với phương pháp đọc trình tự thủ công thì P32 thường được dùng. Ưu thế của nó là mang gốc photphat cao năng bêta mạnh, do đó chỉ cần trong thời gian ngắn là thu được tín hiệu. Hạn chế của phương pháp này là do mang năng lượng cao nên khó phân biệt giữa các băng khác nhau so với dùng S35. Hiện nay để giải quyết vấn đề này người ta dùng P33 tuy giá thành cao nhưng cho kết quả tốt hơn. 3, Thực hiện phản ứng giải trình tự ADN:Enzym thông dụng thường dùng là sequenase (là một dạng của T7 DNA polymerase), enzym này có ưu thế hơn hẳn so với Klenow được dùng trước đây. Phản ứng được thực hiện nhanh hơn và thu được kết quả tối ưu nếu có mặt ion Mn++, ion này giúp cho quá trình sao chép có độ chính xác cao. Trước đây dNTPs đánh dấu với P32 được dùng để đánh dấu sản phẩm. Tuy nhiên ngày nay nhiều người đã chuyển sang dùng S35 thay thế cho P32, kết quả là cho độ phân giải cao hơn. Mới đây phương pháp giải trình tự dựa trên kỹ thuật PCR được gọi là chu kỳ giải trình tự trực tiếp ADN đang thay thế phương pháp cũ dùng enzym sequenase. Về nguyên tắc thì các phương pháp này là giống nhau. Ưu thế của phương pháp này là: lượng ADN đòi hỏi ít và không yêu cầu phải có mức độ tinh sạch cao. Ngoài ra, có một ưu điểm nữa là phản ứng xảy ra ở nhiệt độ cao, do đó đã khắc phục được những hạn chế của các phương pháp khác khi giải trình tự đối với các sợi khuôn có cấu trúc bậc 2 (Fan & cộng sự, tạp chí Biotechniques 21: 1132-1137). 4, Tách sản phẩm trên gel urea-acrylamid:Cho đến nay đã có nhiều tiến bộ trong kỹ thuật điện di gel kể từ năm 1970 khi mà người ta phát hiện ra phương pháp này. Tiến bộ quan trọng nhất là gel gradient tạo ra độ dãn cách thích hợp để đọc được thêm từ 50-100 base. Đầu tiên, gradient được tạo ra giữa acrylamid và gradient muối khi đổ gel. Có thể có cách khác nữa là người ta thay đổi độ dày của gel bằng spacer. Phương pháp dễ nhất là bổ sung nồng độ muối NaOAc vào bể đệm dưới khi chạy gel, kết quả sẽ tạo ra một gradient cần thiết mà không mấy khó khăn. Có nhiều cách cải tiến khác nhau để tạo ra gel có độ phân giải cao, ví dụ tạo ra gradient đối với acrylamid mạch thẳng hay bổ sung một số chất tạo ra gradient (Long Ranger). Mặt khác việc đổ gel cũng được đơn giản hóa bước sử dụng băng dán. Một số người dùng các gel siêu mỏng để đạt độ phân giải cao. Nhiều thiết bị được phát minh nhằm thu nhận các băng đã được tách riêng khi chúng ra khỏi gel, và gần đây những thiết bị này đã được thương mại hóa. Nhuộm bạc là phương pháp tương đối hiệu quả để xác định các trình tự ADN, cách này hạn chế được nhiều bước dùng trong các kỹ thuật dựa vào ảnh bức xạ mà không cần sử dụng chất phóng xạ.
5, Đọc trình tự gene:Hiện nay kỹ thuật đọc phim tự động đã thay thế công việc đọc trình tự ADN buồn tẻ trước đây. Có hàng loạt các thiết bị từ loại có thể ghi lại trình tự dựa vào việc chọn từng loại base đến những thiết bị có thể thực hiện được toàn bộ quá trình này một cách tự động. Hy vọng rằng với những bàn luận ngắn gọn này sẽ giúp bạn làm quen dần với nhiều loại kỹ thuật khác nhau. Ngày nay các thiết bị giải trình tự tự động càng trở lên thông dụng và việc sử dụng loại thiết bị và hóa chất khác nhau rất đa dạng. Việc chọn lựa thiết bị, hóa chất và phương pháp thích hợp để giải trình tự ADN nhanh, chính xác và kinh tế là điều cần được quan tâm đến.
Phương pháp 1: Tinh sạch Plasmid cho giải trình tự ADN.Hiện nay có nhiều kỹ thuật tinh sạch plasmid khác nhau, phương pháp được trình bày dưới đây là phương pháp thu được plasmid có độ tinh sạch cao, có thể dùng cho cả giải trình tự ADN thủ công và tự động hóa. Quá trình này là cải tiến phương pháp sử dụng dịch kiềm làm tan tế bào, sau đó sử dụng sắc ký qua cột trao đổi ion. Cũng như các sản phẩm được lưu hành trên thị trường của các công ty, hạn chế lớn nhất của phương pháp này là giá thành của nhựa trao đổi ion tương đối đắt. Thực tế có rất nhiều công việc phải giải trình tự một cách thủ công và các cán bộ nghiên cứu đã tìm ra nhiều phương pháp tinh sạch khác nhau để thu nhận ADN đạt độ sạch cần thiết, thậm chí có thể dùng cho giải trình tự ADN tự động. Tuy vậy, nhiều người vẫn thích sử dụng cột trao đổi ion, kết quả có thể đọc được tới 600 bps hoặc nhiều hơn nữa. Quá trình tinh sạch như sau: + Nuôi cấy vi khuẩn mang plasmid trên môi trường chọn lọc với kháng sinh tương ứng (khoảng 3 ml).1, Phân 3 ml môi trường LB chứa 100 mg/ml apicilin trong ống nghiệm vô trùng (12X100 nm có nút). 2, Vô trùng đầu que cấy trên lửa và làm nguội trên mặt đĩa thạch. 3, Lấy sinh khối từ một khuẩn lạc và đưa vào ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy trên. 4, Nuôi cấy vi khuẩn 37oC qua đêm có lắc vừa phải. + Chuẩn bị ADN dùng cột Qiagene:Các cột Qiagene được chuẩn bị dễ dàng và nhanh để tinh sạch ADN không cần dùng gradient CsCl. ADN được chuẩn bị theo phương pháp này đạt kết quả rất tốt cho việc biến nạp và giải trình tự gene. Có hai chú ý quan trọng khi dùng cột Quiagene là: (1) Không sử dụng quá nhiều mẫu lên cột, điều này rất quan trọng vì nếu dùng thể tích quá nhiều kết quả là sẽ có nhiều protein ảnh hưởng đến khả năng bám cột của ADN. Với cách này có thể nhận được lượng ADN có chất lượng cao hơn từ thể tích ít hơn. Nếu như lượng ADN thu được ít từ lần thử đầu tiên thì cần thực hiện đúng theo chỉ dẫn để lần thử thứ 2 với thể tích lớn hơn. Khi có một loạt thể tích mẫu được Quiagene khuyến cáo lên cột để đạt được hiệu suất tinh sạch cao nhất thì nên dùng lượng dịch lên cột có thể tích nhỏ nhất. (2) Đảm bảo cột phải được rửa hai lần trước khi giải phóng ADN ra khỏi cột, điều này cũng rất có ý nghĩa vì việc rửa như vậy sẽ loại trừ được protein và các thành phần tạp nhiễm khác. + Các bước dùng cột trao đổi Qiagene (tài liệu hướng dẫn sử dụng Quiagene):1. Ly tâm khoảng 1,3 ml dịch vi khuẩn mang plasmid. Làm tan với 0.3 ml đệm P1 có RNase, chuyển sang tube mới. 2. Thêm vào 0.3 ml đệm P2 và trộn đều, giữ ở nhiệt độ phòng 5 phút (không nên để lâu hơn). 3. Thêm vào 0.3 ml đệm P3 trộn đều ngay nhưng phải nhẹ nhàng, ly tâm ở 4oC trong 30 phút với tốc độ 15000 v/phút. Thu lấy phần trên tủa. 4. Ly tâm lại như bước 3 một lần nữa để loại các phần cặn nếu có. 5. Cân bằng đệm cho cột Qiagene-tip 20 với 1ml QBT và để cho đệm chảy hết tự do. 6. Đưa phần dịch thu được ở bước 4 lên cột và để tự chảy qua cột. 7. Rửa cột 2 lần, mỗi lần 1 ml đệm QC. 8. Thu ADN với 0.8 ml đệm QF. 9. Kết tủa ADN với 0.7 thể tích isopropanol (trước đó đưa về nhiệt độ phòng). Ly tâm 15000 v/phút tại 4oC. 10. Rửa ADN thu được với ethanol 70%, để khô 5 phút và hoà tan lại trong thể tích đệm thích hợp (25ml). Chú ý trong trường hợp mẫu dùng cho giải trình tự ADN tự động huỳnh quang thì hoà tan mẫu trong nước. Nói chung sử dụng cột Qiagene thu được trên 90% ADN và thường được dùng cho tinh sạch Plasmid và cosmit (kích thước dưới 2 Kbs đến lớn hơn 50 Kbs). Số lượng plasmid thu nhận được từ tế bào E.coli phụ thuộc vào hệ tế bào chủ, loại plasmid từ thấp trung bình đến số lượng plamid cao và điều kiện nuôi cấy (có thể tham khảo tài liệu liên quan từ các chỉ dẫn của Qiagene để quyết định số lượng tế bào dùng để xử lý cho mỗi loại kích thước cột). Chú ý cách làm sạch và tái sử dụng cột: 1, Thêm ethanol đầy vào cột, ly tâm. 2, Bỏ ethanol và ly tâm lại một lần nữa. 3, Lặp lại bước 1 và 2 với nước cât. 4, Giữ cột ở trạng thái khô cho đến lần sử dụng về sau. (Cột có thể được dùng cho nhiều lần tuy nhiên khi muốn tinh sạch ADN dùng cho tách dòng thì nên dùng cột mới).
Phương pháp 2. Chuẩn bị gel cho giải trình tự ADNGiới thiệu chung: Phương pháp này giới thiệu cách đổ gel, lên mẫu và chạy gel giải trình tự ADN. Có nhiều cách đổ gel, có thể tham khảo các cách khác nhau để chọn cách tiện ích nhất. Điều quan trọng nhất là các bản kính phải được rửa sạch tuyệt đối. 1, Mang găng tay và loại bỏ hết bột găng tay đi. Rửa bản kính một lần với nước nóng. Sau đó dùng bàn chải rửa với 0.5N NaOH. Lau bản kính với dung dịch Alconox hay chất tẩy rửa có chức năng tương đương. Sau đó rửa sạch lại bằng nước. 2, Rửa các bản kính với nước trao đổi ion sau đó dựng lên giá cho khô, tránh bụi bám vào kính. Lau với ethanol và dùng giấy Kimwipes hay Scott Utinity để lau cho sạch không tạo vết. Kiểm tra lại bụi bám vào kính để lau cho sạch, sau đó kính được lau bằng lớp dịch Rain-X hay Sigmacott, Gel Slick của hãng AT Biochem. Mục đích dùng chất này là giúp cho việc đổ gel dễ dàng hơn và gel không bị dính vào các bản kính. 3, Rửa lại bản đệm cách gel (spacer) với nước đặt vào dọc theo hai cạnh đối xứng của bản kính. 4, Ghép hai bản kính với nhau. Đặt cẩn thận hai bản kính bằng nhau sao cho hai bản spacer sát tận cuối bản gene (tạo mặt phẳng cùng với hai bản kính). Nếu không đảm bảo mặt phẳng thì dễ bị chảy gel trong quá trình đổ gel. Kẹp 2 cạnh của gel tại 3 vị trí. 5, Chuẩn bị gel acrylamid 8% Long Ranger (Hoefer Rig). Trộn đều hỗn dịch: 16 ml Acrylamid Long Ranger (LR) 50%. 5 ml 10X TBE 70 ml 10M Urea (46 gam) Đưa đến thể tích 100 ml với nước Cho vào 800 μl 10% Ammonium persulphat. 50 μl TEMED. Quá trình polyme hóa được thực hiện trong 15 -20 phút. Chạy gel LR trong dải nhiệt độ 50-55oC, nhiệt độ cao hơn 55oC sẽ phá các liên kết acrylamid LR gel là dạng cải biến cho gel acrylamid có một số ưu điểm sau: Thứ nhất là LR gel với nồng độ cao hơn nhưng việc chạy gel thì cũng như gel có nồng độ thấp thông thường, ví dụ LR gel 5% tương đương 4% gel acrylamid với bisacrylamid Thứ 2 là LR gel có khả năng phân giải cao hơn và chạy với tốc độ nhanh hơn 30-40% gel thông thường, gel LR khô nhanh hơn và không bị dính.
Каталог: 2015 2015 -> CHỦ TỊch nưỚC 2015 -> CHỦ TỊch nưỚC 2015 -> Qcvn 81: 2014/bgtvt 2015 -> Tác giả phạm hồng thái bài giảng ngôn ngữ LẬp trình c/C++ 2015 -> TRƯỜng đẠi học ngân hàng tp. Hcm markerting cơ BẢn lớP: mk001-1-111-T01 2015 -> Bch đOÀn tỉnh thanh hóa số: 381 bc/TĐtn-btg đOÀn tncs hồ chí minh 2015 -> Hãy là người đầu tiên biết 2015 -> Có chiến lược toàn diện về việc truyền phát tin tức 2015 -> Transformations 2015 -> SỞ gd&Đt bắc ninh trưỜng thpt hàn thuyêN tải về 0.72 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|