Phân loại vi sinh bằng Sinh Học Phân Tử
tải về 0.72 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- + Điện di plasmid trên gel agarose
+ Tách plasmid:Thông thường lượng plasmid có trong tế bào chiếm < 5% tổng số acid nucleic của tế bào. Như vậy, ta phải thực hiện phép tách plasmid ra khỏi ADN của nhiễm sắc thể. Nói chung có nhiều phương pháp tách plasmid từ vi khuẩn nhưng nguyên tắc chung là phá tế bào vi khuẩn dùng enzym, siêu âm hay trong dung dịch kiềm có chất tẩy rửa là SDS hoặc TritonX-100, sau đó là việc loại ADN của nhiễm sắc thể và protein. Thông thường dùng phương pháp kết tủa với axetat. Lúc này phần lớn các thành phần ADN nhiễm sắc thể và protein của tế bào đã bị kết tủa bị loại bằng li tâm và plasmid nằm trong dịch trên tủa được tách khi kết tủa với ethanol hay isopropanol. Đây là phương pháp có hiệu quả để tách plasmid, trên thực tế hiệu quả tách các plasmid có kích thước nhỏ cao hơn nhiều so với các plasmid có kích thước lớn (>100 Kb). Với các plasmid có kích thước lớn cần các thao tác nhẹ nhàng để tránh đứt gãy do các nguyên nhân cơ học. Với cách tách plasmid như trên thì sản phẩm thu được có lẫn các đoạn ADN có kích thước khoảng 500 bp và nhiễm ARN. Để tránh nhiễm ARN thì cần xử lý với RNase (ribonuclease A). Tuy nhiên, có thể tách theo các phương pháp như: - Tách bằng Caeseium chloride. - Tách bằng KIT QIAGENE. - Tách bằng kỹ thuật khác.
Sau khi thu được plasmid thì phải tiến hành kiểm tra trước khi phân tích kết quả điện di trên gel agarose để biết phổ plasmid và kích thước của chúng. Khi tiến hành điện di thì nồng độ gel khoảng 0.7- 1% với một trong các đệm sau: TAE (40 mM Tris acetat 1mM EDTA, pH 8.0), TBE (89 mM Tris borat 89 mM boric acid, 2 mM EDTA, pH 8.0) và TPE (80 mM Tris- phosphats 2 mM EDTA, pH 8.0). Sau khi điện di, gel được nhuộm với ethidium bromide và phát hiện dưới tia UV (310 nm). Nồng độ ethidium bromide khoảng 5 mg/l và thời gian nhuộm là 10 phút. Sau đó được rửa một lần nhanh bằng nước loại ion trước khi được nhìn dưới UV và chụp ảnh làm tài liệu. Một số vấn đề cần lưu ý khi phân tích plasmid: trên gel thông thường plasmid được thấy ở 3 dạng: dạng siêu xoắn, dạng đứt gãy và dạng mạch thẳng khi bị cắt bởi endonuclease. Dạng di chuyển tốc độ cao hơn là siêu xoắn (Hình 1.1). 
Hình 1.1. Di chuyển của plasmid mạch thẳng (L) và siêu xoắn (OC) khi điện di Đôi khi việc tách plasmid cũng phức tạp đặc biệt trong những trường hợp plasmid có kích thước nhỏ có lẫn các mảnh ADN của nhiễm sắc thể. Trong mọi trường hợp đều có nhiễm các RNA và chúng di động nhanh nhất trừ các trường hợp plasmid như vậy không được nhầm lẫn giữa plasmid siêu xoắn và dạng chính plasmid đứt gãy và plasmid khác. Một chú ý khác là tránh nhầm lẫn khi so sánh kích thước giữa các plasmid siêu xoắn và dạng duỗi xoắn hay mạch thẳng. Thực tế là chỉ có thể so sánh các plasmid siêu soắn với nhau về kích thước. Khi tiến hành phân biệt giữa các chủng vi khuẩn thì đương nhiên là chỉ có thể thực hiện so sánh giữa các chủng cùng có plasmid với nhau. Cũng nên chú ý là không phải các chủng đều giống nhau về đặc tính miễn dịch nếu có chung kết quả phân tích plasmid như nhau. Phép phân tích sẽ có hiệu quả trong các mẫu có nhiều loại plasmid, tuy nhiên cũng phải tính đến việc các plasmid cũng có thể bị mất trong quá trình bảo quản.
Каталог: 2015 2015 -> CHỦ TỊch nưỚC 2015 -> CHỦ TỊch nưỚC 2015 -> Qcvn 81: 2014/bgtvt 2015 -> Tác giả phạm hồng thái bài giảng ngôn ngữ LẬp trình c/C++ 2015 -> TRƯỜng đẠi học ngân hàng tp. Hcm markerting cơ BẢn lớP: mk001-1-111-T01 2015 -> Bch đOÀn tỉnh thanh hóa số: 381 bc/TĐtn-btg đOÀn tncs hồ chí minh 2015 -> Hãy là người đầu tiên biết 2015 -> Có chiến lược toàn diện về việc truyền phát tin tức 2015 -> Transformations 2015 -> SỞ gd&Đt bắc ninh trưỜng thpt hàn thuyêN tải về 0.72 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|