Mọi tài liệu ghi chép nếu không thể được kiểm tra lại thì cũng chỉ là những mảnh giấy vụn mà thôi
phương pháp phân lẬP NẤM, VI KHUẨN VÀ TUYẾN TRÙNG TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM
tải về 0.62 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- 5.1Phân lẬp nẤm
- 5.1.1Buồng giữ ẩm
- 5.1.2Phương pháp pha loãng
- 5.1.3Phát triển và sản sinh bào tử
5phương pháp phân lẬP NẤM, VI KHUẨN VÀ TUYẾN TRÙNG TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆMMẫu bệnh sau khi đem về phòng thí nghiệm được phân thành các nhóm chính. Nhóm ưu tiên bao gồm các mẫu bệnh phân hủy nhanh chóng, ví dụ nấm lớn có thịt dày hoặc các mẫu bệnh mà vi sinh vật hại phải được phân lập từ mô cây. Nhóm khác bao gồm các mẫu bệnh có thể để thêm một thời gian mà không ảnh hưởng gì, ví dụ gỉ sắt, than đen. Các mẫu thuộc nhóm này có thể để khô bằng cách ép báo, sau đó để vào tủ đá -20C trong 7 ngày, có thể giám định sau. Mẫu virus hại thực vật có thể được bảo quản tạm thời trong các lọ làm khô như đã mô tả ở phần 3.3.1. Virus thực vật sẽ không được đề cập thêm trong chương này vì chúng không được phân lập và làm sạch (tách virus ra khỏi các bộ phận cấu thành tế bào) bằng các phương pháp thông thường trong quy trình giám định. Nấm và vi khuẩn thường phải được phân lập và nuôi cấy trước khi có thể giám định. Các vi sinh vật có khả năng phát triển hoại sinh (vi sinh vật ký sinh không bắt buộc hoặc hoại sinh) có thể được nuôi cấy trên môi trường nhân tạo mặc dù không phải loài nào cũng được nuôi cấy dễ dàng. Phân lập nấm từ mô cây bệnh bằng cách cấy những mẩu nhỏ mô bệnh lên môi trường nhân tạo thích hợp, ví dụ môi trường agar - nước cất (water agar) được để trong các đĩa Petri đã khử trùng. Nếu vi sinh vật xuất hiện trên bề mặt mẫu bệnh, dùng que cấy lấy bào tử trực tiếp từ cấu trúc quả thể và cấy lên bề mặt môi trường. Nhiều loài nấm hoại sinh và vi khuẩn thường phát triển thứ sinh trên mô cây bị bệnh. Vì vậy, phải hết sức cẩn thận tránh phân lập các vi sinh vật thứ sinh bằng các phương pháp khử trừng. Tiệt trùng bề mặt các mô cây bệnh có thể giúp loại trừ các vi sinh vật hoại sinh thường phát triển trên bề mặt mô bệnh. Lấy bông hoặc giấy ăn sạch nhúng cồn ethanol 70% lau phần mô bệnh dùng để cấy sau đó để khô. Tốt nhất nên sử dụng các mẩu kính hoặc các bề mặt cứng, nhẵn để cắt mẫu cây bệnh. Tiệt trùng panh và dao bằng cách nhúng chúng vào cồn ethanol 95% và hơ qua ngọn lửa đèn cồn. Không cần phải giữ dụng cụ quá lâu trên ngọn lửa vì lửa có thể làm hỏng chúng. Cồn rất dễ cháy vì vậy phải hết sức cẩn thận không để dụng cụ vừa hơ lửa quá gần lọ hoặc cốc chứa cồn. Tiệt trùng que cấy bằng cách hơ cho nóng đỏ trên lửa đèn cồn. Để que cấy nguội trước khi sử dụng. Khử trùng bề mặt giúp loại bỏ vi sinh vật hoại sinh và tạo điều kiện cho vi sinh vật gây bệnh phát triển tự do, không bị cản trở khi mẫu bệnh được cấy lên môi trường nhân tạo. Nhúng hoặc lau bề mặt vết bệnh bằng cồn ethanol (70%) có thể khử trùng hầu hết các bề mặt mà không cần rửa lại cho hết cồn vì cồn có thể bay hơi, nếu cần có thể hơ nhanh qua lửa đèn cồn. Natri hypochlorite cũng thường được sử dụng khá phổ biến làm dung dịch khử trùng. Thuốc tẩy trên thị trường thường chứa 10-14% Clo. Có thể pha loãng 10 % (dung dịch pha loãng chứa 1-1,4% Clo) và ngâm mẫu khoảng 1-5 phút. Bảo quản dung dịch trong tủ lạnh vì qua thời gian dung dịch sẽ giảm hiệu lực. Thay dung dịch Natri hypochlorite 2-3 tuần / lần. Dung dịch hypochlorite có nhược điểm là có mùi hắc, nếu bị dây ra quần áo thường để lại vết và làm hỏng quần áo. Lựa chọn cách phân lập vi khuẩn và nấm nên dựa vào đặc tính của ký chủ và vi sinh vật hại. 5.1Phân lẬp nẤmCác bước phân lập nấm bệnh từ mô cây bệnh như sau:
Phân lập từ lá Chọn lá có vết bệnh còn trẻ vì nấm thường đang phát triển mạnh ở các mô lá này. Cẩn thận dùng kéo hoặc dao cắt mẫu lá thành từng mẩu nhỏ tại phần tiếp giáp giữa mô khỏe và mô bệnh. Khử trùng bề mặt bằng cách ngâm trong dung dịch natri hypochlorite 10% khoảng 1 – 3 phút rồi rửa qua bằng nước vô trùng. Dùng panh đã khử trùng đặt miếng cấy lên môi trường agar. Phân lập từ thân Trong trường hợp vết bệnh sâu hoặc nằm phía trong bó mạch của cây bệnh, có thể cắt miếng cấy ở các mô bên trong để tránh phải khử trùng bề mặt. Dùng dao (hoặc dụng cụ có thể cắt thân gỗ) đã tiệt trùng qua lửa đèn cồn để chẻ dọc thân bệnh theo chiều từ phần khỏe đến phần bệnh. Dùng dao vô trùng cẩn thận cắt miếng cấy (3-5 mm) tại điểm tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe, chọn mô bệnh còn mới. Dùng panh vô trùng gắp miếng cấy đặt lên đĩa Petri chứa môi trường agar - nước cất (hoặc môi trường khác thích hợp). Đối với các thân cây nhỏ, vết bệnh chủ yếu bị giới hạn bởi phần mô phía ngoài hoặc trong trường hợp không thể cắt miếng cấy ở phần mô bệnh phía trong thì có thể dùng dao vô trùng cắt miếng cấy ở phần tiếp giáp giữa mô khỏe và mô bệnh, sau đó khử trùng bề mặt (1-3 phút trong natri hypochlorite), rửa lại bằng nước vô trùng và cấy lên bề mặt môi trường. Phân lập từ rễ Rửa hết phần đất bám ở bộ phận rễ, sau đó đặt rễ vào một chậu thủy tinh nhỏ hoặc đĩa Petri thủy tinh với mực nước khoảng 2-3 cm sao cho dễ dàng nhìn thấy phần rễ bệnh. Dùng panh hoặc dao xé rễ thành từng mẩu nhỏ. Dùng dao hoặc kéo vô trùng cắt mẩu rễ cấy (dài khoảng 5 mm) tại điểm tiếp giáp giữa mô khỏe và mô bệnh. Có thể khử trùng qua bề mặt miếng cấy, tuy vậy đối với rễ vì rất mỏng manh nên cần rửa lại kỹ bằng nước vô trùng như sau: Đặt các mẩu rễ vào rây có lỗ nhỏ rồi để dưới vòi nước sạch chảy liên tục trong 30 đến 90 phút. Dùng dao hoặc panh vô trùng đặt các miếng cấy lên đĩa Petri có chứa môi trường agar - nước cất (hoặc môi trường khác phù hợp), chú ý ấn nhẹ cho miếng cấy tiếp xúc sâu vào bề mặt môi trường. 5.1.1Buồng giữ ẩmĐôi khi triệu chứng bệnh thể hiện rất rõ nhưng phân lập vi sinh vật gây bệnh lại không đơn giản chút nào. Trong trường hợp khó phân lập vi sinh vật hại có thể để mẫu trong môi trường ẩm, chờ sự xuất hiện của các dạng quả thể và hình thành bào tử. Tuy nhiên, trong điều kiện để ẩm, vi sinh vật hoại sinh cũng rất dễ xuất hiện trên bề mặt mô bệnh. Lau nhẹ bằng cồn công nghiệp hoặc natri hypochlorite 10% có thể giúp hạn chế sự phát triển của vi sinh vật hoại sinh nhưng lại có thể phá hủy cấu trúc vi sinh vật hại trên bề mặt vết bệnh. Để khắc phục tình trạng này có thể rửa mẫu bệnh bằng nước vô trùng rồi làm khô trước khi để ẩm. Hộp để ẩm nên giữ ở nhiệt độ dưới 25°C và tốt nhất là nên để nơi sáng, ví dụ trên bàn thí nghiệm, nhưng không nên để trực tiếp dưới ánh nắng mặt trời, nên giữ ở nhiệt độ không đổi để tránh hơi nước ngưng tụ. Mẫu cần được kiểm tra hàng ngày dưới kính lúp soi nổi với độ phóng đại thấp để quan sát sự xuất hiện của bào tử. Các cấu trúc bào tử có thể được lấy ra bằng que cấy vô trùng để kiểm tra dưới kính hiển vi có độ phóng đại lớn hơn hoặc cấy lên môi trường agar. Đối với các mẫu bệnh nhỏ như lá hoặc cành nhỏ có thể dùng đĩa Petri bằng thủy tinh hoặc nhựa. Các mẫu bệnh lớn hơn có thể để ẩm trong các hộp nhựa và các mẫu quá lớn có thể để ẩm trong các túi nilon lớn. Hộp hoặc túi dùng để ẩm phải được khử trùng. Nếu không thể cho vào nồi hấp được thì phải lau sạch bằng cồn 70% rồi để khô. Túi nilon phải mới chưa sử dụng lần nào. Đặt giấy lọc (đã được hấp khử trùng) vào đĩa Petri hoặc hộp làm ẩm rồi dùng nước cất vô trùng thấm ướt giấy lọc. Khăn giấy dùng trong phòng thí nghiệm có thể được sử dụng bằng cách thấm ướt rồi để vào trong túi nilon hoặc hộp nhựa lớn. Mẫu bệnh phải được để phía trên giấy thấm nước bằng cách đặt một lưới nhựa vào hoặc bất cứ vật gì (nhúng trong cồn 70% và hơ qua ngọn lửa đèn cồn) để kê cao mẫu bệnh trong hộp, tránh tiếp xúc trực tiếp với giấy thấm. 5.1.2Phương pháp pha loãngNấm có thể được phân lập từ đất và bề mặt các bộ phận cây như lá, hoa bằng cách rửa và sử dụng phương pháp pha loãng lần lượt để phân lập được các tản nấm trên môi trường thích hợp, ví dụ như môi trường agar - nước máy (tap water agar) (TWA). Không nên sử dụng các môi trường giàu dinh dưỡng vì chúng sẽ kích thích sự phát triển của cơ quan sinh dưỡng thay vì việc hình thành bào tử. Có thể sử dụng kháng sinh như streptomycin sunfat trộn lẫn vào môi trường agar để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn. Phương pháp pha loãng lần lượt được thực hiện như sau: Nghiền nhỏ hoặc rây mịn đất hoặc các mẩu nhỏ cây bệnh, trộn thật kỹ rồi lấy một lượng nhỏ đổ vào lọ McCartney (dung tích 20 ml) chứa 10 ml nước vô trùng. Dùng pipet vô trùng để lấy 1 ml dung dịch rồi đổ vào lọ McCartney khác chứa 9 ml nước vô trùng. Dùng pipet vô trùng khác để lấy 1 ml dung dịch vừa được pha loãng rồi đổ vào lọ McCartney thứ ba chứa 9 ml nước vô trùng. Cứ tiếp tục pha loãng lần lượt như vậy đến khi dung dịch đạt đến nồng độ mong muốn. Lấy một lượng nhỏ dung dịch pha loãng cuối cùng đổ vào bề mặt môi trường trong đĩa Petri và dùng que thủy tinh dàn đều sao cho dung dịch bao phủ hết bề mặt môi trường. Sau một thời gian các tản nấm bắt đầu xuất hiện, cần cấy truyền ngay lên môi trường phù hợp trước khi chúng mọc chồng lên nhau. Đôi khi chỉ có một lượng rất nhỏ nấm hình thành bào tử, ví dụ: Nấm túi hoặc nấm dạng quả cành. Trong trường hợp này cách tốt nhất là áp dụng phương pháp sau: nhỏ một giọt nước vô trùng vào một lam kính vô trùng rồi gắp một quả thể nấm đặt vào giọt nước, đợi đến khi bào tử được giải phóng khỏi quả thể. Có thể điều chỉnh mật độ bào tử dưới kính hiển vi. Dùng que cấy đưa dịch bào tử vào thành từng vệt trên môi trường TWA. Sau 24 giờ cấy đơn bào tử từ TWA lên môi trường thích hợp. 5.1.3Phát triển và sản sinh bào tửĐối với hầu hết nấm bệnh, sản sinh bào tử là hình thức sinh sản chủ yếu, bào tử sau khi sinh ra sẽ được phát tán trong môi trường sống của chúng. Sự sản sinh bào tử phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường nuôi cấy. Hầu hết loài nấm có thể phát triển tốt ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Sự sản sinh bào tử là yếu tố rất cần thiết cho việc giám định và tạo nguồn nấm để lây bệnh nhân tạo. Điều kiện môi trường nhân tạo như: tủ định ôn tối và các môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng thường không có lợi cho việc sản sinh bào tử ở hầu hết nấm bệnh. Nên sử dụng lá ký chủ (đã tiệt trùng), ví dụ: cọng rơm của lúa mì, lá ngô, lá cẩm chướng… đặt vào môi trường nghèo dinh dưỡng như TWA để kích thích sự sản sinh bào tử. Có thể kích thích sự sản sinh bào tử ở nhiều loài nấm bằng cách đặt dưới ‘ánh sáng đen’ (cực tím yếu). Mặc dù ‘ánh sáng đen’ có thể ảnh hưởng đến màu sắc tản nấm, hình thái đại thể của tản nấm, thậm chí hình thái bào tử, những biến đổi này không ảnh hưởng đến việc giám định. Gắn bóng đèn ‘ánh sáng đen’ vào phía trên giá để đĩa cấy để kích thích sự sản sinh bào tử ở các loài nấm mà việc hình thành bào tử đòi hỏi môi trường ánh sáng này (Hình 8). 
Hình 8 Mặt cắt nghiêng của buồng để mẫu nấm phân lập có ‘ánh sáng đen’ Những điểm cần chú ý khi sử dụng ‘ánh sáng đen’ để kích thích sự hình thành bào tử:.
Каталог: SiteCollectionDocuments SiteCollectionDocuments -> Ủy ban nhân dân tỉnh hà TĨnh cộng hoà Xà HỘi chủ nghĩa việt nam SiteCollectionDocuments -> BỘ TÀi chính số: 136/2009/tt-btc cộng hoà Xà HỘi chủ nghĩa việt nam SiteCollectionDocuments -> Ubnd tỉnh hải dưƠng sở KẾ hoạch và ĐẦu tư SiteCollectionDocuments -> TỈnh hà TĨnh số: 1887 /QĐ-ubnd cộng hòa xã HỘi chủ nghĩa việt nam SiteCollectionDocuments -> V. Lĩnh vực đầu tư vào nông nghiệp, nông thôn SiteCollectionDocuments -> SỞ KẾ hoạch và ĐẦu tư phòng đĂng ký kinh doanh SiteCollectionDocuments -> Mẫu số 04/tp-lltp SiteCollectionDocuments -> TỈnh hà TĨNH SiteCollectionDocuments -> CỘng hòa xã HỘi chủ nghĩa việt nam sở KẾ hoạch và ĐẦu tư SiteCollectionDocuments -> TỈnh hà TĨnh số: 853 /QĐ-ubnd cộng hòa xã HỘi chủ nghĩa việt nam tải về 0.62 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|