Mọi tài liệu ghi chép nếu không thể được kiểm tra lại thì cũng chỉ là những mảnh giấy vụn mà thôi

tải về 0.62 Mb.

trang	11/20
Chuyển đổi dữ liệu	30.08.2016
Kích	0.62 Mb.
	#29193

1 ... 7 8 9 10 11 12 13 14 ... 20

5.2Phân lẬp vi khuẨn

Nếu bệnh do vi khuẩn gây ra, một lượng lớn các tế bào vi khuẩn thường dễ dàng được tìm thấy khi vết bệnh trên lá hoặc trong các bó mạch bị vỡ. Phương pháp phát hiện và phân lập vi khuẩn từ mô cây bệnh như sau:

Rửa phần cây bị bệnh dưới vòi nước chảy để loại bỏ đất, bụi và các sinh vật lẫn tạp. Nếu mẫu bệnh ban đầu được giữ gìn cẩn thận, không bị cọ xát nhiều thì không cần thiết phải khử trùng bề mặt. Nói chung, càng hạn chế khử trùng bề mặt càng tốt, nhất là đối với các mẫu bệnh khô hoặc gần khô. Các chất có tác dụng khử trùng thường xâm nhập rất nhanh và dễ dàng diệt vi khuẩn. Nếu cần thiết phải khử trùng, chỉ nên nhúng mẫu bệnh thật nhanh vào dung dịch natri hypochlorite 10%, sau đó rửa lại bằng nước vô trùng. Nếu mẫu bệnh dày ví dụ như nụ, quả, cành hoặc nốt sưng thì có thể nhúng qua cồn etanol 70% và hơ qua lửa đèn cồn trước khi phân lập.
Cắt vết bệnh thành từng mẩu nhỏ ở phần giữa mô bệnh và mô khỏe, sau đó đặt mẫu lên lam kính tiệt trùng đã nhỏ sẵn một giọt nước vô trùng. Đối với những mô bệnh dày hơn nên dùng que cấy hoặc dao cấy xé nhỏ ra sau khi đặt vào giọt nước vô trùng. Dùng lamen vô trùng đặt lên trên miếng mẫu bệnh và kiểm tra ngay dưới kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần. Có thể hạ thấp tụ quang hoặc đóng phin lọc bàn di mẫu kính hiển vi để nhìn tế bào vi khuẩn rõ hơn. Nếu vết bệnh do vi khuẩn gây nên ta có thể nhìn thấy một đám vi khuẩn chuyển động từ vết cắt. Cần chú ý để không nhầm lẫn vi khuẩn với các thành phần khác như: nhựa cây, hạt tinh bột, plastid. Khi nhìn thấy dịch vi khuẩn chuyển động ra ngoài từ vết cắt, có thể bỏ lamen ra và dùng que cấy vi khuẩn với đầu que cấy hình vòng tròn cấy dịch vi khuẩn lên môi trường agar thích hợp. Trong một số trường hợp có thể phải ngâm mô bệnh trong nước vô trùng khoảng vài giờ để đảm bảo đủ lượng vi khuẩn chuyển động ra ngoài thành dịch, sau đó mới cấy lên môi trường.
Cấy vi khuẩn bằng cách dùng que cấy vi khuẩn chứa dịch vi khuẩn vạch từng vạch lên bề mặt agar. Có thể vạch que cấy theo nhiều cách: Cách 1: tạo thành hình zích zắc trên một góc phần tư của đĩa cấy, bắt đầu từ mép đĩa. Các góc phần tư khác vạch thành các đường thẳng song song, một đầu trùng lên vạch của góc phần tư trước (Hình 9). Que cấy phải được khử trùng trước mỗi lần vạch lên mặt agar. Cách 2: vạch lên toàn bộ bề mặt agar từ trên xuống dưới, từ trái sang phải để phân lập được từng khuẩn lạc riêng biệt.
Dựa vào dự đoán nguyên nhân gây bệnh mà lựa chọn môi trường thích hợp. Môi trường phải được để khô trước khi cấy bằng cách đặt ngược nắp đĩa cấy và để nghiêng trong 24 giờ ở buồng vô trùng hoặc mở nắp trong tủ cấy vô trùng trong 30 phút. Cẩn thận để tránh không cho không khí tạp lẫn vào môi trường.
Đĩa phân lập nên đặt ngược để tránh đọng hơi nước trên bề mặt môi trường. Hầu hết các vi khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 25-28^oC.
Có thể thay đổi một số thao tác trên theo kinh nghiệm hoặc tuân theo các bài báo.

Hình 9 Cách vạch phân lập vi khuẩn trên mặt agar: 1. Vạch phân lập ban đầu từ dịch bào tử. 2. Dùng que cấy sau khi khử trùng vạch thành các vạch thẳng thứ nhất nối với vạch phân lập ban đầu. 3. Các vạch thẳng thứ hai. 4. Các vạch thẳng thứ ba, khuẩn lạc được tạo thành riêng rẽ trên các vạch này.
Sau khi phân lập, đặt đĩa cấy ở điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm và kiểm tra hàng ngày trong 4-5 ngày, hoặc 10-14 ngày đối với các vi khuẩn phát triển chậm. Dựa vào triệu chứng có thể dự đoán vi khuẩn gây bệnh và cấy truyền, kể cả trong trường hợp nhiều vi khuẩn khác nhau cùng xuất hiện trên một đĩa phân lập. Nếu chọn lựa mẫu bệnh và mẫu cấy tốt thì thông thường chỉ phân lập ra một loại vi khuẩn gây bệnh. Nếu từ hai loại vi khuẩn được phát hiện trên mẫu phân lập thì chú ý ghi chép lại mức độ phổ biến của từng loại. Không tính đến các vi khuẩn hoại sinh phổ biến, nên cấy truyền để kiểm tra các vi khuẩn xuất hiện nhiều, đặc biệt là ở các địa điểm khác nhau. Chỉ nên cấy truyền các khuẩn lạc riêng rẽ, tốt nhất lên cùng loại môi trường để trong ống nghiệm.
Có thể áp dụng phương pháp phân lập tương tự như đối với nấm. Cấy trực tiếp mô bệnh lên bề mặt môi trường, vi khuẩn sẽ phát triển xung quanh miếng cấy. Nếu vi khuẩn hoại sinh có mặt trong mẫu cấy, chúng thường lấn át vi khuẩn gây bệnh đặc biệt là đối với các vi khuẩn gây bệnh phát triển chậm. Vì vậy, chỉ áp dụng phương pháp này trong trường hợp phương pháp cấy dịch vi khuẩn không phù hợp.

5.3Phân lẬp tuyẾn trùng

Tuyến trùng (giun tròn không phân đốt) là một nhóm động vật đa dạng, nhỏ, mắt thường không nhìn thấy được. Chúng phân bố ở hầu hết mọi nơi có nước tự do, thậm chí cả những nơi rất ít nước. Tuyến trùng tổng hợp chất dinh dưỡng từ nhiều nguồn khác nhau, nhiều loài có khả năng ký sinh chuyên tính cao. Đại đa số thực vật và động vật là ký chủ của ít nhất một loài tuyến trùng ký sinh. Vì vậy mà rất nhiều tuyến trùng ký sinh là dịch hại quan trọng đối với kinh tế. Ngược lại, các loài tuyến trùng sử dụng vi khuẩn và nấm làm thức ăn (hay còn gọi là tuyến trùng sống tự do) lại có chức năng quan trọng về mặt sinh thái. Ví dụ, tuyến trùng sống tự do đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ dinh dưỡng của hệ sinh thái đất.
Tuyến trùng ký sinh thực vật được phân làm hai nhóm chính: (1) nhóm di chuyển và lấy thức ăn trên bề mặt hoặc giữa các rễ cây (tuyến trùng ký sinh di chuyển) và (2) nhóm không di chuyển, kích thích cây chủ sản xuất ra các cấu trúc bảo vệ và dự trữ dinh dưỡng nuôi tuyến trùng (tuyến trùng ký sinh tại chỗ). Các loài tuyến trùng di chuyển thường có khả năng ký sinh trên nhiều ký chủ khác nhau và gây thiệt hại về kinh tế khi mật độ tuyến trùng cao trừ một số ít giống. Các loài tuyến trùng ký sinh tại chỗ có khả năng ký sinh chuyên tính cao và tác động đến ký chủ ở mức độ phân tử, tác động rất lớn đến năng suất cây trồng nhưng thường gây hại trên ít đối tượng hơn là đối với các loài tuyến trùng di chuyển.
Để giám định tuyến trùng ký sinh thực vật, nên tách tuyến trùng ra khỏi đất hoặc mẫu bệnh và bảo quản cẩn thận.

5.3.1Mẫu đất

Đối với mục đích giám định và lưu giữ mẫu, nên lấy mẫu bệnh ở vùng rễ cây có biểu hiện triệu chứng. Nếu điều tra một khoảnh bị nhiễm bệnh trên một ruộng thì nên lấy mẫu ở khu vực ranh giới giữa khoảnh bị bệnh và khoảnh không bị bệnh, vì ở khu vực này tuyến trùng gây bệnh cây có thể tập trung với mật độ cao nhất. Ngoài ra, cũng nên lấy mẫu ở khu vực không bị bệnh để so sánh. Chiều sâu của điểm lấy mẫu và số lượng mẫu lấy ban đầu cũng quan trọng nhưng chúng tôi sẽ không đề cập sâu về vấn đề đó trong phần này.
Tốt nhất nên lấy mẫu đất ẩm bởi vì một số tuyến trùng ngủ nghỉ trong đất khô thường bị thương do đứt gãy. Đặt mẫu đất trong túi nilon và giữ ở nơi mát mẻ trong quá trình chuyên chở, xử lý mẫu càng sớm càng tốt. Một số tuyến trùng có thể được giữ trong tủ lạnh nhưng không phải là tất cả các loài đều có thể áp dụng cách này. Đối với đất nhẹ, bở, có thể dùng rây (kích thước lỗ rây 10mm) để loại bỏ các mảnh rác sau đó trộn kỹ. Phương pháp này không phải lúc nào cũng áp dụng được với đất nặng.
Phương pháp tách tuyến trùng ra khỏi mẫu bệnh có thể dựa vào sự di chuyển của tuyến trùng (chủ động) hoặc dựa vào kích thước và mật độ tuyến trùng (thụ động). Phương pháp chủ động đơn giản nhất là dùng khay Whitehead hoặc phễu Baermann để tách tuyến trùng đang hoạt động. Mặc dù đơn giản, quá trình này có thể kéo dài 2-4 ngày và mẫu thu được có thể rất ít, do tuyến trùng lớn di chuyển chậm. Phương pháp thụ động được tiến hành bằng cách lọc, gạn và tách với nhiều cách kết hợp khác nhau. Trong phần này, chúng tôi tập trung mô tả phương pháp rây ướt và các phương pháp ly tâm khác nhau. Phương pháp rây ướt có thể dùng để phân lập bào nang của các loài Heteroderid.
Tách tuyến trùng bằng khay

Bỏ đất vào một khay có lót một miếng lưới thô và một lớp vải hoặc giấy thấm, dàn đều đất rồi đổ nước vào sao cho chỉ vừa thấm ướt đất (Hình 10). Sau 1 - 4 ngày, tuyến trùng đang hoạt động sẽ di chuyển xuống dưới, xuyên qua miếng vải vào trong nước dưới đáy khay. Lượng đất sử dụng phụ thuộc vào kích thước của khay; khay loại lớn (450 x 300 mm) có thể chứa một lớp 200g đất mỏng. Lớp đất càng mỏng càng có tác dụng tăng hiệu quả tách tuyến trùng và giảm thời gian tách.

Hình 10 Khay Whitehead dùng để tách tuyến trùng từ đất và cây
Trước khi thu thập tuyến trùng, cẩn thận nhấc phần lưới đỡ lên để hạn chế đất rơi vào phần nước phía dưới. Chuyển phần nước vào một cốc đong và để như vậy vài giờ cho tuyến trùng lắng xuống. Sau đó, tốt nhất nên dùng pipet lấy bớt nước ra chỉ giữ lại khoảng 5-20 ml, cẩn thận để không làm xáo trộn tuyến trùng đã lắng xuống ở dưới. Có thể thay thế phương pháp này bằng cách trút nước có chứa tuyến trùng ra một rây lọc với kích thước lỗ rây 20 - 38 mm. Tuy nhiên, dùng loại rây với lỗ rây càng nhỏ thì càng đắt và khó mua. Tuyến trùng có thể lọt qua rây nhưng có thể khắc phục bằng cách bắt và lọc lại vài lần.
Phễu Baermann

Đ
Đất

ặt đất vào phễu có lót lưới ở dưới và giấy thấm hoặc một miếng vải để trên, cổ phễu được gắn ống cao su có kẹp. Đổ nước vào miệng phễu vừa đủ để thấm ướt đất (Hình 11). Phương pháp này chỉ tiến hành được với một lượng nhỏ đất nhưng có ưu điểm là tuyến trùng tập trung ở phần ống cao su phía trên kẹp và có thể mở kẹp để lấy khoảng 5 đến 10 ml nước chứa tuyến trùng vào ống nghiệm.

Hình 11 Dùng phễu Baermann để tách tuyến trùng từ đất và cây bệnh.
Phương pháp lọc ướt và ly tâm

Đổ đất vào chậu rồi đặt dưới vòi nước chảy, hòa khoảng 4 lít dung dịch đất - nước, tránh không để nước chảy tràn. Khoảng 10 giây sau, các phần tử đất lớn hơn chìm xuống đáy chậu. Phần nước còn lại được lọc qua rây (kích thước lỗ rây 38 mm) xuống một chậu khác. Tuyến trùng bị mắc lại ở lỗ rây sẽ được thu hồi bằng cách ly tâm với một lượng nước rất nhỏ. Tuyến trùng lọt qua rây được thu hồi bằng cách rây lại (có thể rây lại đến 3 lần). Để tăng lượng tuyến trùng thu được, nên lặp lại toàn bộ quá trình từ khâu hòa đất vào nước thêm 2 lần nữa. Tuyến trùng được thu hồi bằng cách ly tâm, cẩn thận rút phần nước phía trên ống nghiệm, chỉ để lại một lượng nước nhỏ chứa tuyến trùng. Sau đó hòa tuyến trùng thu được vào nước đường đặc (450 g/lít) rồi ly tâm lại. Loại bỏ các hợp chất hữu cơ nổi lên trên ống, nước đường cùng với tuyến trùng được rửa qua rây để thu hồi tuyến trùng. Có thể rây lại 2 lần để tận dụng tuyến trùng lọt qua lỗ rây.

Không nên để tuyến trùng quá lâu trong dung dịch đường đặc vì đường có thể kết tinh gây hại đến tuyến trùng. Có thể thay thế dung dịch đường bằng các dung dịch đặc như NaCl, MgSO₄ hoặc keo silica (Ludox, DuPont de Nemours).
Phương pháp tách tuyến trùng bào nang

Hòa tan đất bằng 4 lít nước xả từ vòi, tránh chảy tràn. Để phần đất lắng xuống sau 10 giây, phần nước được lọc qua rây thô (710 mm) đặt trên một rây 250 mm. Đất được rửa lại và lọc qua rây 2 lần nữa. Các chất hữu cơ đọng lại trên rây lỗ nhỏ được thu và để vào phễu Buchner có lót giấy lọc. Kiểm tra bào nang dưới kính lúp soi nổi. Nếu dùng phễu tam giác và hòa tan các hợp chất hữu cơ bằng cồn ethanol 70% thì bào nang sẽ nằm lại thành một vòng ở phía vành ngoài của giấy lọc.

5.3.2Mẫu cây bệnh

Tuyến trùng có thể được tìm thấy trong rễ, thân, lá và hạt của cây, vì vậy phương pháp tách cũng khác nhau tùy từng loại mẫu và các loài tuyến trùng khác nhau. Cách tốt nhất để tách tuyến trùng nội ký sinh di chuyển là dùng thiết bị phun sương, ngoài ra có thể dùng khay Whitehead hoặc phễu Baermann như đã mô tả ở trên. Đối với tuyến trùng không di chuyển có thể dùng dao cắt mô bệnh để lấy tuyến trùng ra hoặc bảo quản in situ. Có thể tách trứng của một số tuyến trùng cố định bằng cách rửa trong thuốc tẩy và lọc qua rây. Tuy nhiên chúng tôi không mô tả phương pháp này ở đây vì trứng tuyến trùng không có ý nghĩa nhiều về mặt phân loại. Tuyến trùng con di chuyển và tuyến trùng đực hình giun được tách bằng phương pháp phun sương.
Phương pháp tách tuyến trùng bằng phun sương

Đặt mẫu bệnh (cắt thành từng mẩu dài 10mm) vào phễu có lót lưới và một mảnh vải phía trên. Để phễu có chứa mẫu bệnh vào buồng phun sương, cứ khoảng 10 phút thì phun sương một lần (Hình 12). Nước thấm qua phễu được hứng vào 1 ống nghiệm với lượng chảy đủ chậm để tuyến trùng lắng xuống đáy ống và được lấy ra sau 2- 4 ngày. Giảm lượng nước trong ống bằng pipet (Dùng pipet để hút bớt nước trong ống nghiệm). Phun sương bảo đảm cho nước được oxy hóa tốt và loại bỏ những độc tố do các mô cây bệnh hoại sinh sản sinh ra, vì thế mà tuyến trùng được giữ ở điều kiện tốt nhất. Có thể áp dụng phương pháp khay Whitehead và phễu Baermann nhưng các phương pháp này có nhiều hạn chế khi áp dụng với mẫu cây bệnh hơn là với mẫu đất.

Hình 12 Tách tuyến trùng từ mô bệnh bằng phương pháp phun sương

Cắt mẫu

Đặt mẫu vào một đĩa Petri. Dùng dao cấy nhọn đầu hoặc que cấy xé mẫu mô bị bệnh tuyến trùng thành từng phần nhỏ dưới kính lúp soi nổi. Tốt nhất nên dùng kết hợp ánh sáng truyền và ánh sáng tới. Có thể quan sát tuyến trùng đã tách ra từ mô bệnh bằng ánh sáng gián tiếp phía dưới kính. Để mẫu trên đĩa Petri như vậy một thời gian có thể tạo điều kiện cho một số tuyến trùng di chuyển ra ngoài mô bệnh. Ánh sáng tới sẽ có ích cho việc quan sát giai đoạn sưng của tuyến trùng cố định như bào nang (Heterodera spp.), nốt sưng (Meloidogyne spp.) u lá và hạt (Anguina spp.).

Có thể quan sát tuyến trùng nội ký sinh bằng cách làm sạch mô bệnh bằng thuốc tẩy, sau đó nhuộm màu bằng nhiều cách khác nhau. Phương pháp này có thể có ích cho mục đích giám định những mẫu bệnh sau khi xử lý không phù hợp để bảo quản lâu dài.

5.3.3Bảo quản và làm tiêu bản

Xử lý nhiệt

Trước khi cố định mẫu tuyến trùng bằng chất bảo quản phải giết chúng để giữ nguyên vẹn cấu trúc. Ngâm tuyến trùng trong nước hoặc chất cố định ở 60^oC, sau đó làm lạnh thật nhanh bằng nước lạnh hoặc chất cố định. Nếu không có bể cách thủy để duy trì nhiệt độ ở 60^oC, có thể đổ nước sôi vào dung dịch chứa tuyến trùng với lượng nước sôi bằng lượng nước chứa tuyến trùng để tạo ra nhiệt độ vừa đủ giết tuyến trùng. Ngoài ra, có thể đặt dung dịch chứa tuyến trùng (mực nước nông) vào tủ sấy ở nhiệt độ 55 – 60^oC, kiểm tra một phút/lần cho đến khi tuyến trùng bị chết. Cần lưu ý trong quá trình xử lý nhiệt không được luộc hoặc để nhiệt độ quá cao vì sẽ phá hủy cấu trúc bên trong của tuyến trùng.

Cố định mẫu

Phương pháp cố định tuyến trùng đơn giản nhất là dùng formaldehyde. Nhỏ dung dịch formaldehyde đậm đặc vào dung dịch chứa tuyến trùng sao cho nồng độ formaldehyde cuối cùng là 2 – 5%. Mẫu được ngâm trong formaldehyde ít nhất 12 giờ, lý tưởng nhất là 2 tuần trước khi tiến hành các bước tiếp theo. Có thể bảo quản mẫu lâu dài trong dung dịch formaldehyde.

Các chất cố định khác thường được sử dụng bao gồm TAF (3% formaldehyde, 0,2 % triethanolamine trong nước cất) và FA4:1 (4% formaldehyde, 0,1% axit axetic trong nước cất). Tuy vậy, các hóa chất này không phù hợp với bảo quản lâu dài. Không sử dụng cồn ethanol để cố định mẫu cho mục đích nghiên cứu về hình thái, nhưng có thể sử dụng cồn ethanol để bảo quản cho mục đích nghiên cứu về sinh học phân tử sau này.
Làm tiêu bản

Để làm tiêu bản với mục đích bảo quản lâu dài, mẫu tuyến trùng được ngâm trong glycerol và để bay hơi chậm. Cho một lượng nhỏ dung dịch glycerol 2 - 5 % (vài ml) vào một đĩa thủy tinh nông, sau đó đặt tuyến trùng vào. Cho đĩa vào tủ sấy ở 40^oC hoặc bình hút ẩm. Để làm chậm lại quá trình bay hơi nước không nên đóng kín nắp đĩa.

Quan sát dưới kính lúp soi nổi để gắp từng mẫu tuyến trùng vào một lam kính hiển vi. Sử dụng que cấy nhọn đầu có dính keo dán lông mi để gắp tuyến trùng. Kéo tuyến trùng dần dần về phía bề mặt có thể quan sát được và nhấc ra khỏi bề mặt bằng cách di chuyển que cấy. Quá trình gắp tuyến trùng ra được tiến hành từ đĩa nông nhưng nhiều khi phải thường xuyên thay đổi cự ly ống kính để tìm tuyến trùng. Muốn thành thạo thao tác này cần phải thực hành nhiều.
Gắp một vài đến 10 tuyến trùng ở các giai đoạn đại diện vào một giọt glycerol khan đặt trên một lam kính. Dùng que cấy đặt cố định mẫu ở chính giữa lam kính. Để giữ cho mẫu tuyến trùng khỏi bị nghiền nát, dùng vụn thủy tinh, lamen vỡ (Số 0) hoặc sáp đặt xung quanh mẫu tuyến trùng. Nhẹ nhàng đặt lamen (tốt nhất nên dùng loại tròn) lên trên giọt glycerol khan, không để glycerol tràn ra mép ngoài lamen. Nếu dùng sáp cạo râu hoặc vòng sáp (nấu chảy ra rồi để nguội) thì phải đặt lam kính lên bếp điện để làm sáp chảy ra. Sau đó hàn lamen lại. Trước đây glycin thường được dùng để hàn lamen nhưng hiện nay glycin không sẵn có trên thị trường vì vậy có thể thay bằng nhựa epoxy hai phần (ví dụ: 5 min. Araldite) hoặc DePeX (có ở nhiều công ty khác nhau). Mặc dù một số nơi có thể sử dụng thuốc đánh móng tay chân nhưng cách này thường không bền trong điều kiện khí hậu nóng.

tải về 0.62 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:

1 ... 7 8 9 10 11 12 13 14 ... 20