MỞ ĐẦu tính CẤP thiẾt cỦa đỀ tài
Phương pháp sinh học phân tử
tải về 1.99 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- Hình 2.2. Sơ đồ vị trí các cặp mồi trên gen bph14
2.3.5. Phương pháp sinh học phân tử* Các cặp mồi khuếch đại các chỉ thị phân tử Khuếch đại chỉ thị liên kết với gen bph1 sử dụng cặp mồi BpE18-3 (R/F), sản phẩm PCR gen giống kháng có băng kích thước 523 bp (Kim và cộng sự, 2005) [67]; khuếch đại chỉ thị liên kết với gen bph3 sử dụng cặp mồi RM589 (R/F) sản phẩm PCR gen giống kháng có băng kích thước 187 bp (Jairin và cộng sự, 2007) [64]; khuếch đại chỉ thị liên kết với gen bph4 sử dụng cặp mồi RM586 (R/F) sản phẩm PCR gen giống kháng có băng kích thước 276 bp (Jairin và cộng sự, 2007) [65]. Khuếch đại chỉ thị RG457L/L liên kết với gen bph10 sử dụng cặp mồi RG457L/L (R/F) (Lang và cộng sự, 1999) [70]. * Phản ứng cắt sản phẩm PCR bằng enzyme HinfI Thành phần phản ứng cắt bao gồm: 3,2 µl nước cất; 1,5 µl buffer (10X); 0,3 µl enzyme HinfI (10 U/µl); 10 µl sản phẩm PCR. Hỗn hợp trên được ủ ở 37oC trong 1,5 giờ; sau đó ủ 4oC qua đêm. Điện di sản phẩm cắt trên agarose gel 1,5% ở 80V trong đệm 1TAE. Sản phẩm PCR của giống nhiễm rầy nâu có 2 băng (200 và 500 bp). Sản phẩm PCR giống kháng có 3 băng (300, 250 và 200 bp). * Thiết kế mồi cho gen bph14 Dựa trên trình tự vùng cds gen kháng rầy nâu bph14 (Accession: FJ941067.1) [49], chúng tôi sử dụng chương trình DNASIS (Hitachi Software Engineering Co., Ltd) để thiết kế 4 cặp mồi, được ký hiệu là: M1-F và R, M2-F và R, M3-F và R, M4-F và R nhằm khuếch đại 4 đoạn overlapping (M1, M2, M3, M4) trên toàn bộ chiều dài vùng cds gen kháng rầy nâu bph14 (Bảng 2.6). Bảng 2.6. Trình tự các cặp mồi và kích thước đoạn DNA được khuếch đại
Vị trí của các cặp mồi trên gen bph14 (có kích thước 9576 bp) được trình bày ở hình 2.2. 
Hình 2.2. Sơ đồ vị trí các cặp mồi trên gen bph14 * Phản ứng PCR PCR được thực hiện trong tổng số 50 µL dung dịch phản ứng gồm 250 ng - 300 ng DNA tổng số, 10 pmol mỗi loại mồi, 2 Master mix (GoTaq® Green Master Mix 2, Promega). Phản ứng khuếch đại DNA được tiến hành trong máy luân nhiệt (iCyler, BioRad) theo quy trình sau: 95oC-5 phút; 30 chu kỳ: 95oC-1 phút, 55oC đến 60oC-1 phút và 72oC-1 phút; 72oC-10 phút. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên agarose gel 1,5% ở 80V trong đệm 1 TAE. Nhuộm agarose gel 15 phút trong dung dịch ethidium bromide (EtBr; 0,5 µg/ml) và quan sát hình ảnh điện di dưới ánh sáng tử ngoại bằng hệ thống Gel Documentation (BioRad). * Tạo dòng đoạn DNA và phân tích trình tự + Quá trình tạo dòng Sản phẩm PCR được sử dụng để gắn vào vector pTZ57R/T. Thành phần phản ứng gắn bao gồm: sản phẩm PCR (khoảng 100 ng), 5 × Ligation buffer, 5 U T4 DNA ligase và 55 ng vector pTZ57R/T; bổ sung nước đến thể tích cuối cùng là 10 µL. Phản ứng gắn được ủ qua đêm ở 14oC. Hỗn hợp phản ứng gắn của các sản phẩm PCR và pTZ57R/T vector được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α (Invitrogen) bằng phương pháp sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giây và làm lạnh nhanh trong đá 3 phút. Sau đó tế bào E. coli được nuôi trên đĩa petri chứa môi trường chọn lọc LB + 1,5% agar + 50 µg/ml amp + 40 µL IPTG 0,1M + 40 µL X-gal (20 mg/ml) ở 37oC qua đêm. Chọn khuẩn lạc đơn màu trắng để sản xuất sinh khối trên môi trường LB lỏng + amp (50 µg/ml) ở 37oC, lắc 200 vòng/phút trong khoảng 15 giờ. Tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp với các sản phẩm PCR dùng để phân tích trình tự nucleotide bằng AccuPrep Plasmid Mini Extraction Kit (Bioneer). Để kiểm tra sự hiện diện của sản phẩm PCR trong vector chúng tôi đã cắt vector bằng enzyme cắt hạn chế EcoRI. Thành phần phản ứng cắt trong 10 μL dung dịch bao gồm 3 μL DNA plasmid tái tổ hợp, 1 μL 10 EcoRI buffer, và 5 U EcoRI. Phản ứng được thực hiện ở 37oC trong 2 giờ. Kết quả phản ứng được kiểm tra bằng điện di agarose gel 0,8% ở 100 V trong đệm 1 TAE.
Trình tự các đoạn DNA tái tổ hợp được phân tích bằng phương pháp dioxy trên máy Instrument Model/Name: 3730xl do cô SM 4 4 4 4 SM 1 1 5 3 ng ty Bioneer, Korea thực hiện. Каталог: files -> 2016 2016 -> CHÍnh phủ Số: 127/2015/NĐ-cp cộng hòa xã HỘi chủ nghĩa việt nam độc lập Tự do Hạnh phúc 2016 -> BỘ CÔng thưƠng cộng hoà XÃ HỘi chủ nghĩa việt nam 2016 -> V/v ủng hộ chương trình Trường Sa xanh 2016 -> TRƯỜng tiểu học yên hòA 2016 -> CỤC ĐIỀu tiếT ĐIỆn lực cộng hòa xã HỘi chủ nghĩa việt nam 2016 -> THÔng báo công tác tuyển sinh năm họC 2016 2017 2016 -> CÔng đOÀN ĐIỆn lực việt nam 2016 -> Công khai chất lượng giáo dục mầm non thực tế của trường mn sơn Ca Trung Hòa Cầu Giấy, Năm học 2015 2016 2016 -> V/v hướng dẫn quyết toán thuế tncn năm 2015 và cấp mst npt tải về 1.99 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|