LỜi cảM ƠN Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến cố pgs. Ts. Trần Công Yên
tải về 0.49 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- 2.3.1.1. Tạo u rắn dưới da
- 2.3.2. Phương pháp khảo sát độc tính của dung dịch nano từ H01 và E6 trên các dòng tế bào ung thư và nguyên bào sợi
- 2.3.3. Phương pháp khảo sát khả năng tạo tương phản ảnh của H01 bằng kỹ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI)
- 2.3.4. Kỹ thuật tiêm tĩnh mạch
- 2.3.5. Phương pháp khảo sát hiệu ứng đốt nhiệt – từ ex vivo
- 2.3.5.2. Phương pháp khảo sát hiệu ứng đốt – nhiệt từ ex vivo
- 2.3.6. Phương pháp khảo sát sự phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) trong một số cơ quan và khối u của chuột Swiss
- 2.3.6.1. Bằng phương pháp đốt nhiệt từ
- 2.3.6.2. Bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)
- 2.3.7. Liệu pháp gia nhiệt in vivo
2.3. Phương pháp nghiên cứu2.3.1. Phương pháp tạo u rắn dưới da và cơ đùi cho chuột nhắt trắng Swiss bằng cấy ghép dòng tế bào Sarcoma 180Phương pháp tạo u rắn cho chuột nhắt trắng Swiss được tiến hành theo phương pháp thường quy của nhóm Nghiên cứu Ung thư Thực nghiệm: Trích báng chuột (đã giữ giống 10 - 12 ngày) bằng kim tiêm loại 18G rồi đem pha loãng bằng dung dịch sinh lý PBS. Xác định mật độ tế bào và tỉ lệ chết (sau khi nhuộm với blue trypan) bằng buồng đếm Thoma dưới kính hiển vi quang học. Sau đó đem pha huyền dịch tế bào sao cho có mật độ 5 x 106 tế bào/ml. 2.3.1.1. Tạo u rắn dưới daTiêm 0.2ml huyền dịch vừa pha vào dưới da chuột (vị trí tiêm là phần ngực, lệch sang bên phải, trước khi tiêm tiến hành tẩy sạch lông chuột quanh vị trí tiêm) mỗi chuột (tương đương 1x106 tế bào ung thư/con). Sau khi cấy ghép tế bào ung thư, chuột được phân lô, đánh dấu, chăm sóc cẩn thận và theo dõi sự phát triển của u rắn đã tạo. 2.3.1.2. Tạo u đùiTiêm 0,2ml huyền dịch vừa pha vào bắp đùi mỗi chuột (tương đương 1x106 tế bào ung thư/con). Sau khi cấy truyền ung thư chuột được phân lô, chăm sóc cẩn thận và theo dõi sự phát triển của u rắn đã tạo. Hằng ngày theo dõi sự phát triển của khối u bằng cách quan sát và đo kích thước, tính thể tích u. Tiến hành đo chiều dài và chiều rộng của khối u bằng thước kẹp hoặc thước dây. Sau đó tính khối lượng của u bằng công thức: V(mg) = a x b2/2 Trong đó a là chiều dài của u (mm) b là chiều rộng của u (mm)
- Tiến hành tách rời các tế bào bằng Trypsin/EDTA. - Thu hoạch tế bào, xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm Thoma. - Nạp tế bào vào các giếng nuôi cấy của đĩa 24 giếng với mật độ 300.000 tế bào/1 giếng. - Ủ các đĩa trên trong tủ ấm 37oC, 5% CO2 trong 24 giờ để tế bào ổn định.
H01 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 E6 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
Nhuộm, đếm và xác định tỷ lệ (%) tế bào sống - Sau khi ủ với hạt từ trong 2 giờ, tiến hành thu hoạch tế bào bằng cách dùng Trypsin/EDTA. - Lấy 50 µl dịch tế bào nhuộm với Blue trypan với tỷ lệ 1:1 ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. - Đếm tế bào để xác định tỷ lệ (%) tế bào sống. - Chụp hình tế bào bằng máy ảnh kĩ thuật số qua kính hiển vi (để minh họa). 2.3.3. Phương pháp khảo sát khả năng tạo tương phản ảnh của H01 bằng kỹ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI)Để khảo sát khả năng tạo tương phản ảnh của H01 bằng kỹ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân, chúng tôi làm thí nghiệm trên chuột Swiss mang u đùi. Tiêm trực tiếp hạt từ H01 vào u đùi chuột, chụp ảnh MRI, quan sát và so sánh với hình ảnh chuột mang u nhưng không tiêm hạt từ. Từ đó kết luận là hạt từ H01 có khả năng gây tương phản ảnh hay không? Sau khi gây u đùi thành công trên chuột, chọn 2 chuột có kích thước đùi u tương đương nhau và 1 chuột bình thường: - Chuột A: Đối chứng sinh học - Chuột B: Đối chứng ung thư - Chuột C: Tiêm trực tiếp 200µl hạt từ H01 vào đùi u của chuột. Chuột C sau khi tiêm để trong thời gian là 10 phút để hạt từ có thể phân tán đều trong khối u. Sau đó cả 3 chuột được gây mê bằng Thiopental nồng độ 50 mg/1ml (mỗi con tiêm 150µl vào xoang bụng). Chuột A, B, C được chụp cộng hưởng từ hạt nhân trên máy MRI 1.5 Gyroscan Philips (Mỹ) tại bệnh viện Quân đội Trung ương 108. Sau khi chụp, phân tích hình ảnh và đưa ra nhận xét.
- Sử dụng bông cồn 70% khử trùng đuôi chuột. - Làm giãn tĩnh mạch. - Dùng kim tiêm loại 1ml chọc vào tĩnh mạch theo góc thấp nhất có thể cho tới khi một nửa mũi kim nằm trong tĩnh mạch chuột thì đẩy từ từ dịch vào. - Nếu không thấy có lực cản thì tiếp tục đẩy hết lượng dịch cần thiết. Nếu thấy có lực cản thì dừng tiêm chỉnh lại mũi kim hoặc chọn một tĩnh mạch khác để tiêm. - Sau khi tiêm nếu đuôi chuột không bị trắng, và khi rút kim thấy máu trào ra theo mũi kim là đã tiêm thành công. Dùng bông cồn khử trùng rồi dùng bông khô bịt vào vết tiêm trên đuôi chuột cho đến khi chuột hết chảy máu. 2.3.5. Phương pháp khảo sát hiệu ứng đốt nhiệt – từ ex vivo2.3.5.1. Khảo sát hiệu ứng đốt nhiệt - từ mẫu E6Pha 1ml dung dịch E6 theo các nồng độ khác nhau, chiếu từ trường trong 30 phút để khảo sát khả năng đốt nhiệt từ của mẫu này. Bảng 2. Nồng độ hạt từ E6 trong thí nghiệm khảo sát hiệu ứng đốt nhiệt từ in vitro
Các mẫu sẽ được chiếu từ trường trong 30 phút, đo nhiệt độ trong quá trình chiếu, từ đó sẽ khảo sát được khả năng đốt – nhiệt từ của mẫu này. 2.3.5.2. Phương pháp khảo sát hiệu ứng đốt – nhiệt từ ex vivo4 chuột có kích thước khối u dưới da tương đối đồng đều, không có dấu hiệu bị hoại tử và được tiêm như bảng bố trí thí nghiệm sau: Bảng 3. Bố trí thí nghiệm gia nhiệt ex vivo khối u rắn dưới da trên chuột Swiss
Đối với những chuột tiêm trực tiếp (M2 và M3), cần để thời gian là 10 phút, 30 phút đối với chuột tiêm tĩnh mạch (M4) cho hạt từ phân bố đều khắp khối u, sau đó dùng kéo tách lấy khối u cho vào ống eppendorf. Đưa ống eppendorf chứa u vào trong lòng cuộn cảm, bật máy phát từ trường và tiến hành chiếu từ trường 30 phút (hình 13). Đo nhiệt độ khối u trong quá trình chiếu từ trường để theo dõi quá trình thay đổi nhiệt độ.
Sau khi gây tạo u rắn dưới da thành công trên chuột, chọn 2 chuột có kích thước khối u tương đối đồng đều: Chuột A - Tiêm ven 2000 µg hạt từ - Để 60 phút - Tách gan, phổi, thận, lách và khối u, gia nhiệt và đo nhiệt độ Chuột B - Tiêm ven 2000 µg hạt từ - Để 180 phút - Tách gan, phổi, thận, lách và khối u, gia nhiệt và đo nhiệt độ  
2.3.6.2. Bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)Cơ sở lí thuyết của phép đo AAS là sự hấp thụ năng lượng (bức xạ đơn sắc) của nguyên tử tự do ở trạng thái hơi khi chiếu chùm tia bức xạ qua đám hơi của nguyên tố ấy trong môi trường hấp thụ. Vì vậy để có thể xác định được hàm lượng nguyên tố sắt có trong các cơ quan của chuột thì phải tro hoá mẫu, loại bỏ toàn bộ các chất hữu cơ, chỉ còn lại các chất vô cơ thành dạng dung dịch. Hệ thống nguyên tử hoá mẫu của máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (Shimadzu – Nhật Bản) sẽ chuyển dung dịch tro hoá thành trạng thái hơi của các nguyên tử tự do. Chiếu chùm tia sáng phát xạ của nguyên tố sắt qua đám hơi nguyên tử vừa điều chế được ở trên. Các nguyên tử của nguyên tố sắt trong đám hơi sẽ hấp thụ những tia bức xạ nhất định và tạo ra phổ hấp thụ của nó. Ở đây, một phần cường độ của chùm sáng đã bị nguyên tử sắt hấp thụ và phụ thuộc vào nồng độ của nguyên tố sắt trong môi trường hấp thụ. Từ đó có thể xác định được nồng độ sắt có trong mẫu. Sau khi gây tạo u rắn dưới da thành công, chọn 2 chuột có kích thước khối u tương đối đồng đều nhau: - Chuột A: Đối chứng ung thư - Chuột B: Tiêm tĩnh mạch 2000µg hạt từ E6, để trong 60 phút. Tách 5 cơ quan là u, gan, thận, lách, phổi của chuột A và B, tiến hành tro hóa. Sau đó đo nồng độ sắt có trong 1ml dịch tro hoá bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (Shimadzu – Nhật Bản) để xác định hàm lượng Fe có trong 5 cơ quan nói trên.
Cân 1g mẫu rồi cho vào bình Kenđan, cho thêm 10ml H2SO4 đặc (d=1.84). đậy bình bằng 1 chiếc phễu thủy tinh và đun cho tới khi ngừng thoát khói trắng mạnh. Lấy ra để nguội rồi cho thêm 4 giọt HClO4 70% (hay 1ml HClO4 15%), tiếp tục đun cho tới khi cặn có màu trắng. Lấy 1ml dịch mẫu vừa tro hóa đo bằng máy hấp thụ nguyên tử để xác định nồng độ sắt C (mg/l). Từ đó có thể tính được hàm lượng sắt có trong 1g nội quan đó theo công thức sau: a = (C x V) trong đó: C – nồng độ sắt có trong mẫu (mg/l) V – thể tích mẫu sau khi tro hóa xong (l) a – Hàm lượng sắt có trong 1g nội quan (g) 2.3.7. Liệu pháp gia nhiệt in vivo6 chuột được cấy ghép với tế bào Sarcoma 180 để tạo u rắn dưới da được phân lô và bố trí thí nghiệm như bảng 4: Bảng 4. Bố trí thí nghiệm gia nhiệt in vivo trên 6 chuột thí nghiệm
Chuột A, B, C, D được chọn làm đối chứng, trong đó:
Chuột E, F được chọn làm thí nghiệm điều trị bằng liệu pháp gia nhiệt, trong đó:
Sau khi tiêm, để chuột yên tĩnh 15 phút cho hạt từ phân tán trong u sau đó cho chuột vào 1 ống Fancol 50ml đã đục lỗ để lưu thông không khí, rồi đưa vào trong lòng cuộn cảm ứng từ sao cho chuột mang khối u nằm ở giữa cuộn dây. Tiến hành chiếu từ trường 30 phút bằng máy phát từ trường xoay chiều RDO, model HFI, với cường độ từ trường 60 Oe, tần số dòng xoay chiều 236 kHz. Sau mỗi lần điều trị gia nhiệt, chúng tôi tiến hành quan sát sự biến đổi của khối u và ghi lại hình ảnh bằng máy chụp ảnh Canon (Nhật). Каталог: files -> ChuaChuyenDoi ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05 ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường tải về 0.49 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
