Đưa plasmid tái tổ hợp vào tế bào

a. Biến nạp
- Hóa biến nạp:
Theo MADNel và Higa, E.coli trở nên rất dễ bị biến nạp bởi ADN ngoại lại khi chúng
được xử lí trong môi trường có CaCl
2
và trước đó được sốc nhiệt ở 42
o
C.
Hóa biến nạp là phương pháp sử dụng chất hóa học, tạo điều kiện để đưa vector tái tổ hợp
vào tế bào chủ. Quá trình được thực hiện theo hai bước sau: Xử lí tế bào chủ trong dung dịch
CaCl
2
ở nhiệt độ thấp nhằm để thay đổi màng tế bào và ủ vector tái tổ hợp với tế bào chủ đã xử lí.
Hiệu suất của phương pháp hóa biến nạp này vào khoảng 10
5
đến 10
6
tế bào nạp trên 1 mg
ADN tái tổ hợp. Qua các kết quả thực nghiệm, người ta thấy rằng các tế bào phát triển ở pha sớm
đến pha giữa dễ được biến nạp hơn. Những nghiên cứu sau này cho thấy việc xử lý tế bào bằng
các ion kim loại hóa trị hai như Mg
+2
, Mn
+2
và Ba
+2
cũng cho khả năng biến nạp lớn. Ngoài ra,
hiệu suất biến nạp còn phụ thuộc vào kích thước của plasmid, plasmid càng nhỏ thì hiệu suất biến
nạp càng cao.
- Điện biến nạp:
Nguyên tắc: Sử dụng dòng điện cao thế cục bộ theo xung để tạo điều kiện cho tế bào hấp
thụ ADN tái tổ hợp được thực hiện dễ dàng.
Hiệu suất: Từ 10
9
đến 10
10
tế bào biến nạp cho 1 mg ADN tái tổ hợp, tuy nhiên, lượng tế
bào biến nạp bị chết nhiều khi có lên tới 70%. Hiệu suất của phương pháp này phụ thuộc vào các
yếu tố sau:
+ Độ mạnh của điện trường tác động khác nhau đối với các loại tế bào khác nhau.
+ Độ dài của hằng số thời gian (thời gian ngắt xung – ms). Theo nhiều nghiên cứu, ở phần
lớn loại tế bào sinh vật, hiệu quả biến nạp cao khi hằng số thời gian đạt được khoảng 6 ms.
+ Nồng độ tế bào chủ
+ Nồng độ ADN tái tổ hợp
+ Giai đoạn phát triển của tế bào (tế bào quá già hoặc quá non đều không thích hợp)
+ Môi trường dung dịch đệm
+ Cấu trúc màng tế bào
b. Biến nạp tế bào trần (protoplast)
Là phương pháp chuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ đã được xử lý bằng polyetylen
glyco (PEG) với nồng độ 30% đến 40%. Đây là phương pháp chuyển gen có hiệu quả cao đói với
tế bào thực vật, các cây mang gen biến nạp ổn định và di truyền qua nhiều thế hệ (Potrykus và
cộng sự - 1995).
Ưu điểm: Tần số biến nạp cao. Có thể chuyển gen vào tế bào trần của bất kỳ loại cây nào.
Đặc biệt là loại cây có giá trị kinh tế cao như lúa, ngô, đại mạch,…
Nhược điểm: Việc tái sinh cây từ tế bào trần còn khó khăn ở một số loài cây.
c. Phương pháp súng bắn gen
Nguyên tắc: Người ta sử dụng hạt kim loại nặng được bao bọc trong ADN và bắn trực tiếp
vào trong tế bào.
27

Ưu điểm: Phương pháp này có thể biến nạp cho tất cả các loài tế bào thực vật, thao tác dễ
dàng.
Nhược điểm: Hiệu suất biến nạp thấp, thường xuyên nhận được cây biến nạp khảm ( cây
có tế bào biến nạp và tế bào không biến nạp).
d. Phương pháp vi tiêm
Phương pháp vi tiêm là phương pháp sử dụng vi kim và kính hiển vi để đưa ADN tái tổ
hợp vào mỗi tế bào nhất định. Đây là quá trình lai ghép cho tế bào bậc cao hoặc tế bào hợp tử.
Tùy thuộc vào từng trường hợp cụ thể, người ta có thể chọn phương pháp sao cho việc đưa ADN
tái tổ hợp vào tế bào có hiệu quả cao.
Ưu điểm: Có thể tối ưu lượng ADN tái tổ hợp đưa vào tế bào và quyết định đưa ADN vào
loại tế bào nào. Đưa chính xác hoặc thậm chí vào tận nhân của tế bào và có thể quan sát được.
Các tế bào có cấu trúc nhỏ như hạt phấn, tế bào tiền phôi cũng có thể tiến hành một cách chính
xác. Có thể biến nạp cho mọi giống cây.
Nhược điểm: Một lần tiên chỉ được một tế bào và thao tác cần phải khéo léo tỉ mỉ.
e. Tải nạp
Tải nạp là hiện tượng chuyển vật liệu di truyền qua vector là virus từ vi khuẩn cho sang vi
khuẩn nhận, trong đó có quá trình chuyển gen và tái tổ hợp gen ở vi khuẩn nhờ thực khuẩn thể
(Bacteriophage).
Thực nghiệm đã chứng minh được tải nạp ở E.coli qua phage λ, phage P1 và ở Bacillus
subtilis qua phage SP10. So với các phương pháp trên, tải nạp có hiệu suất cao hơn. Như vậy, đến
nay đã có nhiều phương pháp hóa học, hóa lý, cơ học và sinh học để đưa ADN tái tổ hợp vào tế
bào chủ. Tùy các đối tượng và các yêu cầu cụ thể, phương pháp này hay phương pháp khác có
hiệu quả và được sử dụng nhiều hơn.

tải về 1.11 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn: