Các kiểu cắt của enzyme cắt hạn chế

- Nối đầu bằng:
Nối đầu bằng được xảy ra khi hai đoạn ADN đầu bằng đứng cạnh nhau. Dưới tác dụng của
enzyme ligase, liên kết phosphodiester giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH) được hình thành và hai
nucleotide được nối lại với nhau. Khả năng nối hai đoạn ADN đầu bằng rất thấp. Để tăng hiệu
suất phản ứng, người ta thường phải tăng nồng độ của các đoạn ADN.
- Nối đầu lệch:
Đầu tiên, hai mảnh ADN đầu lệch do có những nucleotide bổ sung nên chúng tiến lại gần
nhau để tạo liên kết hydro giữa các nucleotide nitơ bổ sung. Sau đó, hai nucleotide của hai đầu
nối tạo liên kết phosphodieste giữa OH(3’) và P(5’) dưới tác dụng của enzyme ligase.
Để phản ứng nối diễn ra thuận lợi, người ta thường xử lí vector và đoạn chèn để phản ứng
nối diễn ra tối ưu nhất. Điều kiện tiên quyết là đoạn chèn và vector đều phải được cắt cùng một
loại enzyme giới hạn để tạo ra các vết giống nhau. Người ta có thể sử dụng đoạn nối (đoạn
oligonucleotide khoảng 10-15 nucleotide) để tạo đầu dính có trình tự nhân biết đối với các cADN
bằng cách ủ đoạn nối với chuỗi ADN đích, sau đó cắt ADN bằng enzyme giới hạn để tạo ra đoạn
chèn có trình tự phù hợp với vector.
Ngoài ra, các đoạn chèn và vector có thể được methyl hóa đầu cắt, giúp làm giảm khả
năng tự nối của chúng, hoặc cắt bằng hai enzyme giới hạn có trình tự nhận biết cách xa nhau.
Hiệu quả phản ứng nối còn phụ thuộc vào nồng độ enzyme, tỷ lệ giữa các đoạn chèn và
vector. Theo các nhà nghiên cứu, tỷ lệ đoạn chèn và vector để có tỷ lệ tối ưu nhất là khoảng 3:1.
- Phương pháp sử dụng enzyme terminal transferase:
Nguyên tắc: Dựa vào đặc tính của enzyme terminal transferase có khả năng gắn kết cùng
một loại nucleotide vào đầu 3’(OH) của phân tử ADN. Cách tạo ADN tái tổ hợp bằng phương
pháp này được tiến hành theo bốn bước sau:
+ Bước 1: Chọn và phân lập ADN lạ đầu bằng và plasmid, giả sử ta phân lập plasmid có
chứa chuỗi đích được nhận biết bởi enzyme BamH I (G/GATCC). Cắt ADN lạ bằng enzyme
exonulcease theo hướng 5’ 3’ đển tạo ADN có hai đầu lệch nhau.
→
+ Bước 2: Ủ ADN lạ với cùng một loại nucleotide dCTP với sự có mặt của enzyme
terminal transferase để tạo đuôi polyC ở đầu 3’(OH) của ADN lạ. Ủ plasmid với cùng một loại
nucleotide dGTP với sự có mặt của enzyme terminal transferase để tạo đuôi polyG ở đầu 3’(OH)
của plasmid hở.
+ Bước 3: Đưa ADN lạ vào plasmid với sự có mặt của enzyme ADN ligase, các đầu mút
của homopolymer có trình tự bổ sung (---GGGG 3’/3’CCCC----) sẽ bắt cặp với nhau.
+ Bước 4: Bổ sung enzyme ADN-polymerase I để gắn các nucleotide tương ứng vào chỗ
trống theo nguyên tắc bổ sung. Enzyme ligase nối liên kết phosphodiester và cuối cùng tạo được
plasmid tái tổ hợp có hai chuỗi đích được nhận biết bởi enzyme BamH I.
Ưu điểm của phương pháp là ghép ADN lạ đầu bằng vào plasmid để tạo ADN tái tổ hợp
và chế tác được ADN đầu lệch từ ADN đầu bằng.

tải về 1.11 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn: