ChuyêN ĐỀ: Ứng dụng di ruyền họC
Chọn lọc dòng tái tổ hợp
tải về 1.11 Mb. Chế độ xem pdf
|
| 3.2.6. Chọn lọc dòng tái tổ hợp
a. Phương pháp lai axit nucleic Để thực hiện phương pháp lai axit nucleic, người ta cần sản xuất sợi đánh dấu (probe) để lai với gen đích nhằm chọn lọc dòng tái tổ hợp. Các sợi đánh dấu thường là các đoạn oligonucleotide ngắn, có đánh dấu nhận biết ở một đầu để phát hiện. Các phân tử cADN là các đoạn đánh dấu có hiệu quả, được sử dụng khá phổ biến. Nếu chuỗi ADN chưa biết trình tự, người ta phải tinh sạch một lượng nhỏ protein tương ứng với ADN đã nghiên cứu và từ đó tổng hợp đoạn đánh dấu. Còn nếu phân tử ADN đã biết trình tự thì công việc dễ dàng hơn nhiều. Dựa vào khả năng biến tính khi nhiệt độ tăng và hồi tính khi hạ nhiệt độ từ từ của ADN để tiến hành lai. b. Phương pháp sử dụng kháng thể Người ta dựa vào phản ứng đặc trưng của một số protein kháng thể để có thể nhận biết được các phân tử lai thông qua các chỉ thị màu, phản ứng kết tủa… 28 Phương pháp này chủ yếu sử dụng trong y học với hai yêu cầu sau: ADN cần nghiên cứu được gắn vào vector phải biểu hiện protein khi tạo dòng và đồng thời, vector tạo dòng phải là vector biểu hiện (ví dụ như vector λgt11). Protein biểu hiện cần phải có kháng thể đặc trưng. c. Phương pháp phát hiện nhờ mất hoạt tính do đoạn chèn - Nguyên tắc: Dựa vào sự mất khả năng kháng thuốc của vi khuẩn mang vector tái tổ hợp khi chúng được nuôi cấy trong môi trường kháng sinh. Phạm vi sử dụng: Phương pháp này dùng cho vector có từ hai gen kháng thuốc trở lên, ví dụ như vector pBR322. Trong plasmid pBR322 có hai gen kháng thuốc Amp R và Tet R . Trên các gen này có những điểm nhận biết của các enzyme giới hạn – vị trí chèn các đoạn ADN từ vật cho (đoạn chèn). Khi gắn ADN đoạn chèn vào một trong hai gen nói trên thì gen nhận đoạn cài mất khả năng kháng thuốc, chứng tỏ những khuẩn lạc đó có chứa gen cần tạo dòng. Ngoài ra, sự phân biệt dòng tái tổ hợp với dòng gốc được thực hiện bằng các kỹ thuật vi sinh vật với các dấu hiệu chỉ thị về di truyền phân tử. Hầu hết các vector đều được thiết kế với các tiêu chí riêng biệt để có thể chọn lọc dòng hiệu quả. Có ba kiểu chọn lọc dòng. - Chọn lọc âm tính: Sự chọn lọc âm tính là việc sử dụng sự mất hoạt tính kháng kháng sinh của vector. Đối với các vector này thường được thiết kế với hai vị trí có chứa gen kháng kháng sinh khác nhau. Khi nhân dòng gen vào vị trí có chứa gen kháng kháng sinh, đặc tính kháng của vector sẽ bị mất. - Chọn lọc lưỡng tính: Nhân dòng vào vector chứa gen -galactosidase. Gen nhân dòng được nối vào vị trí chứa β gen -galactosidase và làm mất hoạt tính của nó. Khi nuôi cấy trên môi trường, cả hai dòng tái tổ β hợp và các dạng gốc đều phát triển, tuy nhiên, ở dạng tái tổ hợp, gen tổng hợp -galactosidase bị β đột biến và các khuẩn lạc không có màu xanh. Vì thế, các khuẩn lạc có màu xanh bị loại bỏ. - Chọn lọc dương tính: Trong vector có chứa gen gây độc với tế bào và quá trình nhân dòng chèn gen nghiên cứu là biến tính gen gây độc. Từ đó, thể tái tổ hợp được phát triển, còn thể dại bị chết. tải về 1.11 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|