Hai loại vector thông dụng trong kĩ thuật ADN tái tổ hợp

Hình 3: Các plasmid có chứa khởi điểm tái bản (ori), các điểm cắt của một số retrictase
và các gene kháng ampicillin (AmpR), kanamycin (KanR).
Trong số các phage dùng làm vector thì phage lambda (λ) có nhiều ưu thế nhất, bởi lẽ ở
phần giữa của bộ gene có chứa một số gene không quan trọng và không liên quan với sự tái bản
của nó, nên thuận lợi cho việc xen đoạn DNA mong muốn vào đây. Các phage không chứa các
gene kháng thuốc cho nên việc theo dõi phage tái tổ hợp được xác định dựa vào các vết tan
dương tính (positive plaques) trên nền vi khuẩn.
3.2. Các công đoạn chính tạo ADN tái tổ hợp
3.2.1. Phân lập đoạn ADN/gen
a. Tách các đoạn ADN từ kiểu gen
Phương pháp này được thực hiện như sau: ADN bộ gen (kiểu gen ADN) của một sinh vật
được cắt thành các đoạn nhỏ dài khoảng 20 kb bằng enzyme cắt giới hạn rồi gắn vào vector để
xây dựng thư viện gen (kiểu genic library).
Thư viện gen là một tập hợp các đoạn ADN cùng đại diện một kiểu gen nguyên vẹn (hoặc
gần nguyên vẹn) của các cá thể mà ADN được bắt nguồn từ đó. Thông thường, ADN bộ gen
được cắt bằng enzyme giới hạn có trình tự nhận biết 4 bp. Tuy nhiên, không phải dễ dàng thu
được một gen nguyên vẹn nằm trên một đoạn ADN. Trong thực tế, một đoạn gen thường bị cắt
thành nhiều đoạn ADN do vị trí nhận biết của enzyme nằm ngay trong gen.
Có thể sử dụng ADN tách từ các loại mô khác nhau để xây dựng thư viện gen. Các thư
viện gen của một cơ thể chứa các đoạn ADN dài ngắn khác nhau nhưng thông tin di truyền
không thay đổi. Ngược lại, thư viện cADN được xây dựng từ các mARN. Trong cơ thể có những
gen chỉ hoạt động trong những loại tế bào nhất định, do đó giữa các mô khác nhau có thể thu
được các phân tử mARN khác nhau. Vì vậy, một cơ thể có thể có nhiều thư viện cADN khác
nhau đặc trưng cho từng loại tổ chức chuyên hóa.
23

b. Sinh tổng hợp cADN từ mARN
Đoạn ADN được tổng hợp dựa trên khuôn mẫu mARN bằng sự sao mã ngược (reverse
transcription) được gọi là cADN (complementary ADN). Quá trình tổng hợp cADN trải qua 3
giai đoạn như sau:
- Tổng hợp sợi cADN thứ nhất: Tổng hợp sợi cADN thứ nhất dựa trên khuôn mẫu mARN
nhờ phản ứng phiên mã ngược. Thành phần chính của phản ứng bao gồm enzyme phiên mã
ngược, các oligo (dT) mồi sẽ liên kết với đuôi polyA của mARN, dNTPs, các đệm.
- Tổng hợp sợi cADN thứ 2: Gây biến tính (bằng nhiệt) thể lai mARN-cADN để cắt ARN
bằng RNase H của E.coli. Thông thường đầu tận cùng 3’ của các cADN sợi đơn có khả năng tạo
thành các cấu trúc vòng kẹp tóc (hairpin loop) và vì thế có thể được sử dụng để là primer cho quá
trình tổng hợp sợi cADN thứ 2 bằng ADN pholymerase I của E.coli.
- Cắt vòng kẹp tóc bằng nuclease S1: Sau khi tổng hợp xong ADN, sợi thứ nhất và thứ hai
liên kết với nhau tại vị trí kẹp tóc và được cắt bởi nuclease S1. Kết quả đầu cắt tận cùng thường
là đầu bằng. Sợi đôi cADN sau đó được tách thành các tiểu phần theo kích thước và các phân tử
lớn nhất được gắn vào các plasmid của vi khuẩn. Hoặc một tập hợp đầy đủ các kích thước của
cADN sợi đôi được tạo dòng trong bacteriophage để xây dựng thư viện cADN.
c. Phân lập đoạn ADN bằng PCR 
Đây là phương pháp sử dụng rất phổ biến hiện nay. Nó ít thời gian và hiệu quả cao hơn rất
nhiều so với hai phương pháp trên. Tuy nhiên, để thực hiện phương pháp này, thông thường trình
tự nucleotide của gen nghiên cứu đã được xác định. Trên cơ sở đó, đoạn mồi được thiết kế để bắt
cặp với gen xác định và phản ứng PCR được tiến hành để phân lập đoạn gen đó.

tải về 1.11 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn: