ChuyêN ĐỀ: Ứng dụng di ruyền họC

Enzyme này dịch chuyển điểm đứt (nick) trên một sợi của ADN sợi đôi. Chức năng chính
của enzyme là sửa sai dọc theo phân tử ADN. Nếu gặp chỗ sai sót, nó sẽ đi ngược lại để cắt bỏ
sau đó mới tổng hợp ADN. ADN polymerase I của E.coli mang chuỗi polypeptide có khối lượng
phân tử (M) là 109.000 Da với ba hoạt tính riêng biệt:
- Hoạt tính polymerase 5’-3’: ADN polymerase I của E.coli xúc tác cho sự tổng hợp ADN
theo chiều 5’-3’ bằng cách bổ sung các gốc nucleotide vào đầu tận cùng 3’-OH được tạo ra khi
một sợi của phân tử ADN sợi đôi bị đứt.
- Hoạt tính exonuclease 3’-5’: ADN polymerase I của E.coli cắt các chuỗi nucleotide ở các
đầu tự do của ADN , xúc tác cho sự thoái biến bậc thang từ đầu 3’ của cả ADN sợi đôi và sợi đơn
khi không có các dNTP. Trong trường hợp không có các dNTP, hoạt tính exonuclease trên sợi đôi
sẽ bị ức chế bởi hoạt tính polymerase. Trong quá trình tổng hợp ADN, hoạt tính exonuclease thực
hiện chức năng đọc sửa (proofreading) bằng cách cắt bỏ những nucleotide bị lắp ráp sai.
- Hoạt tính exonuclease 5’-3’: ADN polymerase I của E.coli có thể chuyển chỗ các
nucleotide từ phía 5’ của điểm đứt và bổ sung tức thời các nucleotide từ phía 3’ tạo ra chuyển
động của điểm đứt dọc theo ADN.
- Ứng dụng chính:
+ Đánh dấu đoạn ADN để làm mẫu dò dịch chuyển điểm đứt.
+ Khởi đầu cho sự tổng hợp sợi thứ hai trong tạo dòng cADN.
+ Xác định trình tự ADN bằng phương pháp Sanger.
b. Đoạn Klenow của ADN polymerase I của E.coli
Enzyme này có tác dụng lấp đầy các đầu khuyết 3’ của ADN sợi đôi. Do ADN polymerase
I có ba hoạt tính, nhưng hoạt tính exonuclease 5’-3’ ít sử dụng nên Klenow đã dùng protease để
cắt bớt đoạn có hoạt tính đó. Vì vậy, khối lượng phân tử enzyme chỉ còn lại 76.000 Da (được gọi
là đoạn lớn của ADN polymerase I).
- Ứng dụng chính:
+ Làm hóa đầu khuyết 3’ do enzyme hạn chế tạo ra.
+ Đánh dấu đầu tận cùng của các đoạn ADN bằng cách dùng [
32
P]dNTP để làm đầy đầu
khuyết 3’.
+ Đánh dấu đầu tận cùng của các phân tử ADN mang đầu lồi 3’. Đầu tiên, hoạt tính
exonuclease 3’-5’ loại bỏ đầu lồi 3’ để tạo ra đầu khuyết 3’. Sau đó, nhờ sự có mặt ở nồng độ cao
của một tiền chất được đánh dấu đồng vị phóng xạ, sự thoái tiến bậc thang được cân bằng do sự
hợp nhất của các dNTP ở đầu 3’.
+ Tổng hợp sợi thứ hai của cADN trong tạo dòng cADN.
+ Tổng hợp ADN sợi đôi từ các khuôn mẫu sợi đơn trong phát sinh đột biến in vitro.
c. ADN polymerase của bacteriophage T4 (T4-infected E.coli)
Enzyme này giống đoạn Klenow của ADN polymerase I của E.coli. ADN polymerase của
phage T4 (M=144.000 Da) có hoạt tính polymerase 5’-3’ và exonuclease 3’-5’. Tuy nhiên, hoạt
tính exonuclease của ADN polymerase phage T4 lớn hơn của ADN polymerase I đến 200 lần.
18

Đoạn Klenow phải có đoạn mồi mới tổng hợp ADN được, còn ADN polymerase T4 thì không
cần mồi cũng tổng hợp được ADN.
- Ứng dụng chính:
+ Làm đầy hoặc đánh dấu đầu khuyết 3’ do enzyme hạn chế tạo ra.
+ Đánh dấu tận cùng của các phân tử ADN mang đầu lồi 3’, tương tự như ứng dụng của
đoạn Klenow.
+ Đánh dấu các đoạn ADN để làm mẫu dò.
+ Biến đổi đầu so le của ADN sợi đôi thành đầu bằng.
d. Taq ADN polymerase
Taq ADN polymerase (Taq pol) là một loại ADN polymerase chịu nhiệt (M= 65.000 Da)
của vi khuẩn Thermus aquaticus. Enzyme này được dùng để kiểm tra sự có mặt hoặc không của
một gen bằng tìm cách xúc tác cho sự tổng hợp gen đó ở điều kiện in vitro nhờ phản ứng chuỗi
polymerase (PCR). Taq polymerase thay thế cho ADN polymerase I của E.coli do có khả năng
chịu nhiệt cao phù hợp với điều kiện phản ứng của PCR và nó có thể tổng hợp một sợi ADN dài
1kb trong vòng 30 giây ở 72
o
C.
Một trong những hạn chế của Taq pol là sự chính xác không cao trong quá trình sao chép
của nó do bị mất cơ chế đọc sửa (hoạt tính exonuclease 3’-5’). Enzyme Taq pol thương mại có tỷ
sao chép lỗi 1/10.000 nucleotide và có thể tạo ra 16% sản phẩm PCR dài 1 kb bị đột biến trong
phản ứng khuếch đại. Mặc dù có nhược điểm trên, Taq polymerase vẫn có thể được dùng trong
các thí nghiệm đòi hỏi một trình tự di truyền chính xác (như trong tạo dòng phân tử). Tuy nhiên,
kết quả cho ra một vector mang đoạn chèn (sản phẩm PCR) cần phải được kiểm tra bằng đọc
trình tự.
Ưu điểm của Taq polymerase là sản xuất các đoạn gen mang hai đầu lồi A. Điều này đặc
biệt hữu ích trong “TA cloning” là kỹ thuật mà vector (plasmid) được sử dụng đã có sẵn hai đầu
lồi T bổ sung với hai đầu lồi A của sản phẩm PCR, nhờ đó đã làm tăng hiệu quả của phản ứng
gắn.
Ngoài Taq polymerase, nhiều ADN polymerase chịu nhiệt khác đã được đưa ra thị trường
với các chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn. Chẳng hạn: Pfu ADN polymerase được tách
chiết từ Pyrococcus furiosus, thường được dùng thay cho hoặc kết hợp với Taq polymerase.
Enzyme này ổn nhiệt hơn và có khả năng đọc sửa, vì thế cho tỷ lệ sao chép lỗi thấp. Hoặc Tth
ADN polymerase được tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động như một
enzyme phiên mã ngược khi có mặt ARN khuôn mẫu và ion Mn
2+
. Tuy nhiên, trong trường hợp
có sự hiện diện của ADN khuôn mẫu và ion Mg
2+
, thì Tth polymerase lại xúc tác phản ứng
khuếch đại ADN. Enzyme này cho phép khuếch đại khuôn mẫu là ARN thông qua sự hình thành
của cADN.
e. ARN polymerase (ADN-dependent ARN polymerase)
Các bacteriophage SP6, T7 và T3 sản xuất enzyme ARN polymerase để khởi đầu tổng hợp
ARN trên khuôn mẫu ADN sợi đôi có mang promoter đặc trưng bacteriophage. Quá trình tổng
hợp này không cần mồi.
- Ứng dụng chính:
19

+ Sản xuất ARN để làm mẫu dò.
+ Xác định trình tự của một phân tử ADN được tạo dòng trong một vector có mang
promoter đặc trưng cho bacteriophage SP6, T7 hoặc T3.
+ Sản xuất một lượng lớn ARN từ một phân tử ADN được tạo dòng để nghiên cứu về cấu
trúc, điều hòa và các mối tương tác của phiên bản ARN.
f. Enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase)
Đây là enzyme tổng hợp ADN từ khuôn mẫu ARN. Enzyme này có ở trong các virus:
AMV (avian myeloblastosis virus), Mo-MLV (moloney murine leukemia virus) thuộc nhóm virus
ngược (retrovirus: virus mang ARN) và có hoạt tính sau:
- Hoạt tính polymerase 5’-3’: Tổng hợp ADN theo chiều 5’-3’. Cơ chất của nó là ARN
hay ADN (sợi đơn hoặc sợi đôi).
- Hoạt tính Rnase H: Bao gồm hai hoạt tính exoribonuclease 5’-3’ và 3’-5’ phân hủy các
ADN hoặc ARN trong tổ hợp lai.
Enzyme này được dùng trong kỹ thuật di truyền là nhờ vào khả năng tổng hợp được
cADN của chúng.
Người ta có thể tách chiết mARN ở những tế bào tổng hợp protein mạnh, sau đó dùng
enzyme phiên mã ngược để tổng hợp cADN. Có thể tổng hợp nên oligonucleotide rồi dùng nó để
xác định trình tự ADN.
g. Teminal transferase
Hoạt tính của enzyme này là xúc tác gắn các nucleotide vào đầu 3’-OH tự do của ADN sợi
đôi làm lồi ra một đầu ở cuối sợi ADN. Phản ứng này là ngẫu nhiên, do đó thành phần nucleotide
của đầu lồi phụ thuộc vào nồng độ của bốn loại nucleotide có trong phản ứng.
-Ứng dụng chính:
+ Thêm đuôi đồng trùng hợp (homopolymer) để tạo ra đầu so le cho phân tử ADN dùng
trong tạo dòng.
+ Đánh dấu đầu 3’-OH của ADN trong kỹ thuật xác định trình tự gen theo Maxan và
Gilbert.

tải về 1.11 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn: