ChuyêN ĐỀ: Ứng dụng di ruyền họC
Lai tại chỗ (In situ hybridization)
tải về 1.11 Mb. Chế độ xem pdf
|
| 2.5.3. Lai tại chỗ (In situ hybridization)
Lai tại chỗ là một kỹ thuật được sử dụng để định vị những đoạn axit nucleic bổ sung với mẫu dò được đánh dấu đặc thù trên nhiễm sắc thể trong tế bào sinh vật nhân thật hoặc tế bào vi khuẩn. Để tiến hành định vị những trình tự ADN đặc thù, người ta tiến hành xử lý mẫu vật để làm biến tính ADN và loại bỏ những ARN và protein trong mẫu. Đoạn ADN quan tâm sau đó được phát hiện bằng cách lai với mẫu dò axit nucleic đánh dấu. Phân bố của những ARN đặc thù trong một số tế bào nhiễm sắc thể, có thể được định vị bằng cách lai với những mẫu thử ( chứa những ARN hoặc ADN mẫu dò thích hợp) được tách cắt thành từng phần hoặc được ép nén. Lai tại chỗ là một kiểu lai phân tử đó trình tự axit nucleic cần tìm (trình tự đính) nằm nguyên ngay trong tế bào hay trong mô. Như vậy phương pháp này không cần khâu tách chiết axit nucleic ra khỏi mô và tế bào. Phương pháp được ứng dụng trong việc định vị gen trên nhiễm sắc thể, trong lai khuẩn lạc có chứa plasmid tái tổ hợp hoặc nghiên cứu quá trình phiên mã từng mARN trong mô chuyên biệt trong tế bào và mô. a. Lai khuẩn lạc (colony hybridization) Là kỹ thuật được dùng để phát hiện những dòng vi khuẩn có mang vector tái tổ hợp cần tìm trong một ngân hàng gen. Để lai khuẩn lạc, người ta tiến hành nuôi cấy tế bào vi khuẩn trên đĩa petri chứa nền agar để tạo các khuẩn lạc (colony). Sau đó chuyển các khuẩn lạc sang bám chặt vào màng nitrocellulose hoặc nylon bằng cách áp màng lai, màng lai sau đó được xử lí bằng NaOH để làm phá vỡ tế bào vi khuẩn, đồng thời làm biến tính ADN giải phóng ADN và ADN này được cố định trên màng bằng cách nhúng vào nước nhiệt độ 80 0 C. Các bước lai tiến hành 13 như đã làm trên pha rắn. Sau khi lai với mẫu dò đánh dấu, vị trí của những khuẩn lạc chứa trình tự mục tiêu được xác định bằng phóng xạ tự ghi không bằng phương pháp không dùng phóng xạ, ta sẽ biết và thu được những dòng vi khuẩn có chứa gen mục tiêu mong muốn. b. Lai nhiễm sắc thể (chromosome hybridization) Sử dụng phương pháp này để định vị nuôi cấy chính xác và sự phân bố của một trình tự ADN mục tiêu trên nhiễm sắc thể nhờ một mẫu dò chuyên biệt. Để tiến hành, người ta thường dùng nhiễm sắc thể ở giai đoạn kỳ giữa (thường lấy nhiễm sắc thể của tế bào bạch cầu) được xử lý bằng các phương pháp tế bào học trên lam kính. Đó là công đoạn loại bỏ ARN bằng cách xử lý enzyme ARNse, loại bỏ protein bằng cách xử lý proteinase K. Sau đó, nhiễm sắc thể cố định trên lam kính được lai với mẫu dò đánh dấu. Dùng các phương pháp phát hiện phân tử lai tùy theo phương thức đánh dấu được sử dụng, chúng ta có thể quan sát và phát hiện được vị trí của phân tử lai trên nhiễm sắc thể bằng kính hiển vi. c. Lai trên bào và mô (Cell ADN tissues hybridization) Trong cơ thể, ở các tế bào và mô khác nhau, các ARN (đặc biệt là các mARN) có sự phân bố về thời gian và sự khác nhau giữa các tế bào và mô. Sự phân bố về thời gian này có liên quan đến chức năng và sự điều hòa biểu hiện của gen cũng như tương tác giữa mARN với các thành phần khác nhau của tế bào và mô. Nếu nghiên cứu các ARN tách chiết thì không thể nắm được các thông tin kể trên, muốn hiểu được phải tiến hành sử dụng phương pháp lai trên tế bào và mô. Để tiến hành, người ta xử lý mô qua các bước như: Cố định mẫu, khử nước, tẩm paraffin, cắt thành từng lát mỏng (7-10 m), trải chúng trên lame. Cuối cùng thực hiện các thao tác xử lý µ mẫu, lai và phát hiện ra phân tử có trong mô tế bào cũng tương tự như trong phương pháp lai trên nhiễm sắc thể. Kết quả được đọc trên lame bằng kính hiển vi. Phương pháp này thường được sử dụng trong các trường hợp đối tượng nghiên cứu có tổ chức phức tạp, bao gồm nhiều tập hợp tế bào khác nhau như não bộ. Thông tin này có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định vai trò và chức năng của mARN đối với tình hình hiện trạng mô. Trong phương pháp miễn dịch tế bào có thể phát hiện được một protein chuyên biệt có trong một tế bào thông qua kháng thể đặc trưng của nó. Khi phối hợp giữa các phương pháp miễn dịch (lai protein) với phương pháp lai tại chỗ ARN, người ta có thể phát hiện sự tồn tại đồng thời giữa mARN và protein trong mô. Từ đó xác định được mối tương quan giữa hoạt động phiên mã và dịch mã của một gen. Bằng cách lai nhiều lát cắt liên tục của một mô (các cấu trúc của lát cắt gần như đồng nhất) với nhiều mẫu dò khác nhau, người ta có thể xác định được vị trí, sự phân bố và tương quan giữa nhiều mARN cùng tham gia vào một quá trình sống. Hiện nay, nhờ sự tiến bộ rất nhanh trong kỹ thuật đánh dấu mẫu dò bằng hóa chất phát quang, đã giúp đỡ nhiều cho phương pháp lai tại chỗ. Đặc biệt giúp chúng ta có thể quan sát đồng thời một lúc nhiều tập hợp các phân tử lai khác nhau nếu ta sử dụng các mẫu dò được đánh dấu bằng các hóa chất biểu hiện nhiều màu khác nhau. tải về 1.11 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|