Lai ptotein – Phương pháp Western blotting

giai đoạn phản ứng hóa học để nhận biết mối liên kết giữa kháng thể và kháng nguyên đặc thù.
Đó là:
- Hoạt hóa HRPO bằng cách oxy hóa gốc đường bằng NaIO
4
.
- Hình thành cầu nối giữa enzyme peroxidase hoạt hóa với gốc amino của kháng thể để tạo
thành vị trí Schiff base.
- Khử Schiff base bằng NaBH
4
nhằm biến N thành NH để tạo thành phức hợp bền vững
giữa HRPO với kháng thể IgG.
- Phát hiện ra kết tủa màu vàng của MUP (4-methylumbellieryl phospate) hay NPP
(p-nitrophenyl phosphate). Có 2 phương pháp xác định lai giữa kháng nguyên với kháng thể, trên
pha lỏng gọi là phương pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) và trên pha rắn là
Western blotting.
Đầu tiên các mẫu protein kiểm tra được biến tính, phân giải thành các tiểu cấu tử. Các hóa
chất thường sử dụng là SDS (sodium dodecyl sulfate), DTT (dithiothreitol) hoặc 2-ME
(2-mercaptoethanol). Sau đó các mẫu protein này được phân tách nhờ điện di SDS-PAGE, hoặc
bằng điện di 2 chiều trong một số trường hợp. Các vệt vạch protein được chuyển lên và gắn chặt
trên bề mặt màng nilon, nitrocelulose hoặc PVDF rồi tiến hành phản ứng lai với phức enzyme
kháng thể bền vững đã chuẩn bị trước. Tất cả các vị trí kháng nguyên tồn tại trên màng được cố
định bằng cách cho màng lai chìm ngập trong môi trường chứa một số chất tăng khả năng cố
định. Sau đó cho lai với kháng thể kết gắn enzyme bền vững, màng lai được rửa sạch nhằm loại
bỏ những kháng nguyên không lai hoặc lai không đặc thù thì sẽ phát sáng màu tùy việc chúng ta
sử dụng enzyme horseradish peroxidase (HRPO), alkaline photphatase hay urease cặp đôi với
kháng thể.

tải về 1.11 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn: