ChuyêN ĐỀ: Ứng dụng di ruyền họC
tải về 1.11 Mb. Chế độ xem pdf
|
| 3.1.4. Các enzyme cắt
Là nhóm các enzyme xúc tác thủy phân liên kết phosphodiester trong phân tử ADN hoặc ARN, bao gồm các endonuclease (cắt bên trong phân tử axit nucleic) và exonuclease (cắt bên ngoài phân tử axit nucleic). Các enzyme giới hạn cũng là các endonuclease, nhưng chúng có tính đặc hiệu rất cao cho từng trình tự 4 hoặc 6 nucleotide. Dưới đây là các nuclease chính thường được sử dụng. a. Deoxyribonuclease I (Dnase I) Dnase I xúc tác thủy phân ADN sợi đơn hoặc sợi đôi ở các liên kết phosphodiester nằm bên cạnh các nucleotide pyrimidine, tạo ra các oligonucleotide và các oligonucleotide có đầu tận cùng 5’ monophosphate. Khi có mặt Mg 2+ , Dnase I tác dụng độc lập trên mỗi sợi ADN và các vị trí cắt được phân bố ngẫu nhiên. Trong công nghệ sinh học, Dnase I thường là sản phẩm tách từ tụy bò. Khi có mặt Mn 2+ , Dnase I sẽ cắt cả hai sợi ADN gần như ở cùng một vị trí để tạo ra các đoạn ADN đầu bằng hoặc đầu lồi nhưng chỉ nhô ra một hoặc hai nucleotide. - Ứng dụng chính: 21 + Tạo ra các điểm đứt (nick) trên ADN sợi đôi để đánh dấu mẫu dò đồng vị phóng xạ bằng phương pháp dịch chuyển điểm đứt. + Tạo ra các dòng ngẫu nhiên để phân tích trình tự trong bacteriophage M13 vector. + Phân tích phức hợp protein: ADN (DNase footprinting). + Loại bỏ ADN trong các phân đoạn ARN hay protein. b. Nuclease S1 (Tách chiết từ Aspergillus oryzae) Enzyme nuclease S1 cắt ADN sợi đơn hoặc ARN để tạo ra đầu 5’ monophosphate hoặc các oligonuclease. ADN sợi đôi và thể lai ADN/ARN ít chịu tác dụng của enzyme này. Tuy nhiên, các axit nucleic sợi đôi sẽ bị nuclease S1 cắt hoàn toàn nếu chúng bị xử lí với một lượng rất lớn enzyme. Một lượng vừa đủ của enzyme sẽ tách các axit nucleic sợi đôi ở các điểm đứt hoặc các lỗ hổng nhỏ thành hai hoặc nhiều đoạn. - Ứng dụng chính + Phân tích cấu trúc thể lai ADN/ARN. + Loại bỏ các sợi đơn trên đầu so le ra khỏi đoạn ADN sợi đôi để tạo ra các đầu bằng. + Mở vòng cặp tóc xuất hiện trong quá trình tổng hợp cADN sợi đôi. Một enzyme có hoạt tính tương tự nuclease S1 là mung-bean nuclease (endonuclease) được tách chiết từ mầm đậu xanh (Phaseolus aureus). c. Exonuclease III (Exo III) (Tách chiết từ E.coli) Exo III xúc tác loại bỏ các 5’ mononucleotide từ đầu 3’ OH của ADN sợi đôi (ADN mạch thẳng hoặc mạch vòng chứa các điểm đứt hoặc lỗ hổng). Hoạt tính enzyme cho kết quả tạo thành các vùng sợi đơn dài trong ADN sợi đôi. Enzyme này có ba loại hoạt tính khác nhau: Endonuclease đặc hiệu cho apurinic ADN, RNase H và 3’ phosphatase (loại bỏ đầu 3’ phosphate nhưng không cắt các liên kết phosphodiester bên trong). Exo III không cắt các ADN sợi đơn hoặc ADN sợi đôi có đầu lồi 3’. tải về 1.11 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|