ChuyêN ĐỀ: Ứng dụng di ruyền họC
tải về 1.11 Mb. Chế độ xem pdf
|
| 3.1.3. Các enzyme nối
Enzyme ligase thường dùng là của phage T4 xâm nhiễm trong E.coli. Chức năng của enzyme này là nối các đoạn hở bằng liên kết cộng hóa trị, sử dụng năng lượng ATP. a. Bacteriophage T4 ADN ligase Enzyme này là một chuỗi polypeptide (M= 68.000 Da) xúc tác cho sự tạo thành liên kết phosphodiester giữa đầu 3’-OH tự do của một phân tử ADN này với đầu cuối 5’-PO 4 của một phân tử ADN khác. ADN ligase có tác dụng cho cả trường hợp đầu so le lẫn đầu bằng, tuy nhiên đối với đầu bằng enzyme đòi hỏi nồng độ cao hơn và điều kiện phản ứng cũng khác. b. Bacteriophage T4 ARN ligase Enzyme này xúc tác cho mối liên kết cộng hóa trị giữa nhóm 5’-PO4 của ADN sợi đơn hoặc ARN với nhóm 3’-OH của ADN sợi đơn hoặc ARN. 20 c. Bacteriophage T4 polynucleotide kigase Enzyme này xúc tác cho mối liên kết cộng hóa trị giữa nhóm 5’-PO 4 của ADN sợi đơn hoặc ARN. Hai loại phản ứng thường có thể xảy ra là phản ứng thuận và phản ứng trao đổi. Trong phản ứng thuận, nhóm γ-phosphate được chuyển tói đầu 5’ của ADN đã được dephosphotyl hóa (mất nhóm phosphate). Trong phản ứng trao đổi, khi có một ADP thừa, enzyme sẽ chuyển nhóm 5’ phosphate từ ADN đã được phosphoryl hóa tới ADP, ADN sau đó sẽ được phosphoryl hóa trở lại bằng cách nhận một nhóm γ-phosphate đã được đánh dấu đồng vị phóng xạ từ một phân tử [γ- 32 P]ATP. -Ứng dụng chính: + Đánh dấu phóng xạ đầu 5’ của ADN để phân tích trình tự bằng phương pháp Maxam và Gilbert (1977), dùng làm mẫu do trong các kỹ thuật lai phân tử. + Phosphotyl hóa các đoạn nối (linker) và các đoạn ADN không có nhóm 5’ phosphate để chuẩn bị cho phản ứng gắn trong phương pháp tạo dòng. d. Alkaline phosphatase Chức năng chính của alkaline phosphatase là xúc tác loại bỏ nhóm 5’ phosphate khỏi ADN và ARN. Có hai loại thường được sử dụng hiện nay là enzyme alkaline của vi khuẩn và ruột bê. - Ứng dụng chính: + Loại bỏ nhóm 5’ phosphate khỏi ADN hoặc ARN trước khi đánh dấu 5’ bằng 32 P . + Loại bỏ nhóm 5’ phosphate khỏi các đoạn ADN để ngăn cản sự tự gắn. Trong kỹ thuật tạo dòng, khi một vector được mở vòng ADN bằng một enzyme giới hạn rồi sau đó được loại bỏ nhóm 5’ phosphate thì nó không thể tự gắn lại (tự tái tạo lại vòng). Chỉ khi có đoạn ADN ngoại lai mang các đầu 5’ phosphate cần thiết được đưa vào thì phản ứng gắn giữa vector và ADN ngoại lai mới xảy ra. tải về 1.11 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|