DẦu thầu dầu bằng nấm men yarrowia lipolytica luận văn thạc sĩ khoa họC
Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị, dụng cụ và môi trường nghiên cứu
tải về 0.51 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- Bảng 2.1 Các hoá chất sử dụng.
- 2.2.2. Lên men theo mẻ trên nồi 5L
- 2.2.3. Lên men theo mẻ - có tiếp dần cơ chất, trên nồi 5L
- 2.2.4. Lên men theo mẻ trên nồi 50L
- 2.2.5. Lên men theo mẻ có - tiếp dần cơ chất, trên nồi 50L
- 2.2.7.1. Lactone hóa có gia nhiệt
- 2.2.7.2. Lactone hóa không gia nhiệt
- 2.2.8. Chưng cất dịch lên men đã được lactone hóa
- 2.2.11 Làm sạch dịch chiết cô đặc
- 2.2.11.2 Làm sạch dịch chiết cô đặc bằng Na 2 SO 4 khan
2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị, dụng cụ và môi trường nghiên cứu2.1.1. Vi sinh vật Trong nghiên cứu này, chủng nấm men Yarrowia lipolytica VTP-5 được dùng để chuyển hóa dầu thầu dầu thành - decalactone. Đây là chủng nấm men chuyển hóa chất béo (oleaginous yeast), trước đây được phân lập từ nem chua, hiện đang được lưu giữ tại Bộ môn Công nghệ Enzyme và Protein - Viện Công nghiệp Thực phẩm. 2.1.2. Hóa chấtBảng 2.1 Các hoá chất sử dụng.
2.1.3. Thiết bịCác thiết bị phụ vụ cho quá trình nghiên cứu và thực hiện thí nghiệm bao gồm các loại thiết bị và nguồn gốc như sau: Bảng 2.2 Thiết bị trong nghiên cứu
2.1.4. Môi trường (g/L) * Môi trường giữ giống (YMA) Yeast extract 3 Malt extract 3 Peptone 5 Glucose 10 Agar 20
* Môi trường hoạt hóa giống: Môi trường YM dịch thể Yeast extract 3 Malt extract 3 Peptone 5 Glucose 10
Peptone 20 Yeast extrac 10 Glucose 20 * Môi trường lên men Dầu thầu dầu (castor oil) 100 Pepton 20 Tween 80 1 2.2. Phương pháp 2.2.1. Nhân giống và lên men trên máy lắc * Nhân giống Cấy 10 vòng que cấy giống từ ống thạch nghiêng vào bình tam giác chứa 50mL môi trường nhân giống, nuôi lắc 200 v/p, trong 9h ở 27ºC để đạt mật độ tế bào cao nhất (6,5.106/mL). Huyền dịch thu được này được coi là giống cấp 1 để tiếp giống cấy vào các môi trường lên men. * Lên men trên máy lắc Việc lên men trên máy lắc, được diễn ra sau tiếp giống cấp 1 vào các bình chứa 100 mL môi trường lên men trong thời gian 4 ngày, ở nhiệt độ 27ºC, tốc độ lắc 200 v/p. Các khảo sát sau đây đã được tiến hành đối với lên men lắc: a) Khảo sát tốc độ lắc Các tốc độ lắc 140, 200, 250, 300 v/p đã được khảo sát đối với 4 bình tam giác mỗi bình chứa 100 mL môi trường lên men. b) Khảo sát pH môi trường ban đầu: pH= 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7 Các pH ban đầu khác nhau (4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7), đã được khảo sát đối với 7 bình tam giác 500 mL, mỗi bình chứa 100 mL môi trường lên men. Tiếp giống cấp 1 vào môi trường lên men, tiến hành lên men trong 4 ngày ở nhiệt độ 27ºC, tốc độ lắc 200 v/p. c) Khảo sát tỉ lệ tiếp giống (tỉ lệ cấy) Khảo sát các tỉ lệ tiếp giống 5%, 10%, 15%, 20%, thể tích môi trường lên men. Nuôi giống trong 9h, Sau đó tiếp giống vào các bình lên men đã được chuẩn bị trước với các tỉ lệ giống như trên. Lên men trong thời gian 4 ngày, ở nhiệt độ 27ºC, tốc độ lắc 200 v/p. d) Khảo sát thời gian lên men Thời gian lên men được khảo sát là 3, 4, 5, 6 ngày, tất cả được tiếp giống cấp 1 với tỉ lệ 10% (6,5.106 tế bào/mL), có pH ban đầu là 5,4 ở 27oC, lắc 200 v/p. 2.2.2. Lên men theo mẻ trên nồi 5LCác thông số lên men: Nồi lên men có thể tích làm việc 3 L; tỉ lệ tiếp giống 10% (v/v), nhiệt độ 270C, khuấy 200 v/p, cấp khí 0,7 L/L môi trường/phút; tần suất lấy mẫu phân tích: 8 giờ một lần; thời điểm kết thúc lên men: 64h. 2.2.3. Lên men theo mẻ - có tiếp dần cơ chất, trên nồi 5LKhác với lên men theo mẻ đã được trình bày ở mục 2.2.2, nồng độ cơ chất (dầu thầu dầu) ban đầu trong môi trường lên men chỉ là 40% nồng độ tổng, tức 120g/3L. Phần còn lại, 60% tức 180g/3L được tiếp dần vào nồi lên men ở thời điểm 16h lên men, với tốc độ 2mL/phút. Tần suất lấy mẫu như ở lên men theo mẻ. 2.2.4. Lên men theo mẻ trên nồi 50LCác thông số lên men như sau:
2.2.5. Lên men theo mẻ có - tiếp dần cơ chất, trên nồi 50LKhác với ở mục 2.2.4 ở đây nồng độ dầu thầu dầu sử dụng ban đầu là 40% nồng độ tổng, tức 1200g/30L, phần còn lại, 60% tức 1800g/30L được tiếp dần vào nồi lên men ở thời điểm 16h với tốc độ 20mL/phút, tần suất lấy mẫu 4h một lần, kết thúc lên men tại thời điểm 64h. 2.2.6. Đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu Dụng cụ: buồng đếm hồng cầu Thomas. Buồng đếm này có 16 khối lập phương, mỗi khối lớn được chia thành 16 khối nhỏ. Kích thước khối như sau: Chiều sâu các khối: 1/10mm Chiều dài cạnh khối nhỏ: 1/20mm Diện tích đáy khối nhỏ: (1/20)2 = 1/400mm2 Thể tích một khối nhỏ: (1/20)3 = 1/4000mm3 Thể tích một khối lớn: 16x 1/4000mm3 = 1/250mm3 Thể tích buồng đếm: 16x 1/250mm3= 0,064 mm3
Tính kết quả theo công thức: N= n/v.f Trong đó: N: số tế bào/1mL dịch mẫu n: số tế bào trung bình trong 1 khối lớn v: thể tích khối lớn = 1/250mm3 f: hệ số pha loãng mẫu Để xác định số tế bào sống/tổng số tế bào trong mẫu: Tiến hành nhuộm mẫu bằng xanh Metylen (1 giọt mẫu: 1 giọt xanh metylen), các tế bào chết sẽ bắt màu xanh.
Sau thủ tục này sẽ thu được dịch lactone hóa 1 (có gia nhiệt) chứa γ-decalctone, dịch này được dùng để tách chiết γ-decalctone bằng dung môi. 2.2.7.2. Lactone hóa không gia nhiệtDịch sau lên men đã loại bỏ sinh khối được chia làm 3 mẫu: mẫu 1 giữ nguyên không chỉnh pH; mẫu 2 chỉnh pH về 1,5; mẫu 3 chỉnh pH về 2, sau thủ tục này sẽ thu được dịch lactone hóa 2 (không gia nhiệt) chứa -decalactone, dịch này để dùng tách chiết -decalactone (mục 2.2.9), hoặc chưng cất thành dịch ngưng tụ chứa -decalactone (mục 2.2.8) cũng dùng để tách chiết. 2.2.8. Chưng cất dịch lên men đã được lactone hóaDịch lactone hóa ở pH 2 như trên, được chưng cất bằng thiết bị Clevenger ở nhiệt độ 100ºC để thu nhận dịch ngưng tụ chứa các cấu tử hương thơm. 2.2.9. Tách chiết -decalactone bằng dung môi Dịch lactone hóa 1 và 2 cũng như dịch ngưng tụ, ở các mục 2.2.7-2.2.8, được dùng làm nguồn để thu nhận γ-decalactone bằng cách chiết rút bằng dung môi: 1,5 ml mỗi dung dịch đó được bổ xung 1,5 ml dung môi diethyl ether, lắc nhẹ 1,5 phút, để yên và dùng pipet hút lấy phần dịch phía trên chính là dịch chiết chứa -decalactone. 2.2.10. Loại bỏ dung môi khỏi dịch chiết Dịch chiết thu được ở mục 2.2.9 được loại bỏ dung môi bằng cột crudemar hoặc bằng thiết bị cô quay chân không buchi RE, nguyên lý hoạt động của hai thiết bị này như sau: dịch chiết được hút vào bình cầu crudema hoặc bình cầu cô quay của thiết bị ở nhiệt độ 45ºC, tới khi diethyl ether bay hết. Dùng pipet hút lượng dịch cô còn lại (chứa γ-decalactone) được phân tích bằng GC. 2.2.11 Làm sạch dịch chiết cô đặc2.2.11.1 Làm sạch dịch chiết cô đặc bằng cách rửa kiềmDịch chiết cô đặc chứa (γ-decalactone) được làm sạch bằng cách rửa bằng kiềm (NaOH pH 11-12), sau đó chiết lại bằng diethyl ether, rồi loại bỏ dung môi bằng thiết bị cô quay chân không, đến khi dung môi bay hơi hết. Dịch thu được sau thủ tục này được gọi là dịch chiết sạch 1 (rửa bằng kiềm) sẽ được định lượng γ-decalactone bằng GC hoặc dùng cho thủ tục cuối cùng: đánh giá cảm quan. 2.2.11.2 Làm sạch dịch chiết cô đặc bằng Na2SO4 khanDịch sau cô đặc được pha vào cồn tuyệt đối (tỷ lệ 20 ml dịch cồn/50 ml dịch cô đặc) rồi loại bỏ dung môi nhờ thiết bị cô quay chân không tới khi cồn và diethyl ether còn sót lại bay hơi hết, dịch thu được tiếp tục được làm sạch bằng Na2SO4 khan. Dịch thu được sau thủ tục này được gọi là dịch chiết sạch 2 (bằng Na2SO4) . 2.2.12. Đánh giá cảm quan Đánh giá sự sinh trưởng nấm men thông qua khối lượng sinh khối. Đánh giá màu sắc dịch sau lên men thông qua sự đồng đều của màu sắc trong các bình sau lên men.
Sử dụng phương pháp sắc ký khí (Gas Chromatography-GC) được thực hiện tại Trung tâm phân tích, Viện Khoa học hình sự, Bộ Công An Nguyên lý: Mẫu được phân tích GC bơm vào trong cột và theo dòng khí mang (thường là nitơ) đưa đến cột sắc ký (pha tĩnh). Mẫu khi qua cột này sẽ được hấp phụ lên trên pha tĩnh đó. Sau đó, các chất lần lượt tách khỏi cột theo dòng khí ra và được ghi nhận bởi đầu dò. Từ các tín hiệu nhận được, máy tính sẽ xử lý và biểu hiện kết quả bằng sắc ký đồ. Hàm lượng mỗi chất được xác định nhờ thời lượng lưu trên sắc ký đồ. Thực hiện: Dùng pipet sạch hút chính xác 100 μl mẫu phân tích GC sau đó bổ xung dung dịch chuẩn: γ-decalactone (mg/mL), cho vào ống Eppendort sạch đã thanh trùng có đánh số kí hiệu mẫu phân tích GC. Thông số thiết bị sắc kí: + Thiết bị GC Aligent 6890 A/ USA + Thể tích mẫu tiêm: 2 μl + Khí mang: N2 + Detector ion hóa ngọn lửa (FID), khí đốt của FID: H2 + O2 + Cột HP1: 30μm, nhiệt độ từ 80OC- 250OC trong 10 phút, kích thước cột 30μm x 250μm x 0.25 μm. Sơ đồ quá trình lên men thu nhận -decalactone:
Kết quả: lượng γ-decalactone
Hoạt hóa
Tinh sạch, sau đó phân tích GC 
Dịch môi trường YM chứa nấm men Dịch chiết cô đặc (chứa γ-decalactone) Nhân giống
Lên men Dịch chiết (chứa γ-decalactone) Huyền dịch sau lên men Chiết bằng dung môi 
Ly tâm (10000 v/p) loại sinh khối 
Dịch chưng cất Chiết bằng dung môi Dịch sau lên men (đã loại sinh khối) 
Chưng cất Lactone hóa bằng HCl pH 1,5-2 Dịch lactone hóa
Каталог: files -> ChuaChuyenDoi ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05 ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường tải về 0.51 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|
C - 90