Ứng dụng của nấm men chuyển hóa chất béo

1.4. Ứng dụng của nấm men chuyển hóa chất béo

Những chủng nấm men ưa béo có khả năng chuyển hóa chất béo cao nhất đã được báo cáo bao gồm Candida 107, Rhorosporidium toruloides, Yarrowia lipolytica. Hấp thụ lipit và axit béo ở nhóm nấm men này đã được nghiên cứu trên một hệ thống lên men gồm hai giai đoạn trong nuôi cấy, theo đó ở giai đoạn đầu vi sinh vật được nuôi trong điều kiện hạn chế nguồn cacbon; ở giai đoạn tiếp theo, người ta bổ sung nguồn cacbon là glucose vào môi trường nuôi cấy, chính chất này sẽ kích thích tế tào hấp thụ lipit. Lượng lipit được tích lũy có tỷ lệ rất cao: so với trọng lượng khô của tế bào ở Rhodosporidium toruloides hoặc Rhodotorula glutinis là hơn 70%, ở Y. lipolytica  là từ 38% - 50% tùy thuộc chế độ nuôi cấy, với Candida 107 tỷ lệ này là 28% [11][21][27].

Một số chủng nấm men chuyển hóa chất béo có khả năng tích lũy carotenoids trong tế bào (tiền vitamin A, cơ chất tổng hợp chất thơm…). Về mặt sinh lý và sinh thái vi sinh vật, việc tích lũy carotenoid giúp tế bào vi sinh vật tăng cường sức đề kháng trước tác nhân bất lợi từ môi trường như tia tử ngoại. Một vài chủng trong số đó đã được nghiên cứu và triển khai ứng dụng trong việc sản xuất carotennoid, như Rhodotorula glutinis TISTR 5159, Rhodotorula glutinis CCY 20-2-26, Rhodototula gracillis… Khả năng tích lũy carotenoid của chúng tăng lên khi nuôi cấy trong điều kiện bất lợi như môi trường có H₂O₂ đồng thời bị hạn chế nguồn nitơ, oxy. Khi đó sản lượng carotenoid có thể đạt 26,30mg/L dịch nuôi cấy. Các chủng nấm men này đã được ứng dụng để lên men trong đó sử dụng nguồn cacbon của nước thải từ các nhà máy sản xuất dầu cọ, dầu đậu nành, mà chỉ cần bổ sung thêm nguồn nitơ là (NH₄)₂SO₄ và chất hoạt động bề mặt như Tween 20 [14][26].

Một trong những enzyme ngoại bào quan trọng nhất của vi sinh vật là lipase; enzyme này được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, thực phẩm, dược phẩm, xử lý chất thải. Nhiều nhóm nấm men chuyển hóa chất béo có khả năng tổng hợp lipase với sản lượng cao. Những cơ chất tốt nhất cho những chủng nấm men này sử dụng để tổng hợp lipase là dầu cọ, dầu oliu, dầu hạt cải, dầu đậu nành… Với nồng độ từ 0,4- 2% những dầu này có thể cho sản lượng lipase 30,4 U/ml môi trường. Những loài nấm men chuyển hóa chất béo có khả năng tổng hợp lipase được quan tâm nghiên cứu là Rhodotorula glutinis, Yarrowia lipolytica [30][32][35].

Các nấm men ưa béo có khả năng chuyển hóa chất béo, dầu và các hợp chất hydrocacbon kị nước là Yarrowia lipolytica, Rhodotorula sp., Candida sp., Lipomyces sp., Trichosporon sp.,… Đặc biệt loài Yarrowia lipolytica là loại nấm men “không truyền thống” được nghiên cứu nhiều nhất. Yarrowia lipolytica có khả năng sử dụng các cơ chất kỵ nước như các ankan, axít béo và dầu, một cách có hiệu quả, như một nguồn dinh dưỡng chính để sinh tổng hợp sinh khối tế bào hoặc chuyển hóa để tạo thành axít citric, axít 2-keto glutaric, các chất thơm họ lactone [23].

Sự phân giải chất béo C18 bởi nấm men thông thường dẫn tới sự tạo thành các chất bay hơi axetyl (C2) và propionyl (C3). Tuy nhiên, một số chủng lại có khả năng tạo thành các hợp chất C8 – C15 rất có giá trị thương mại. Các hợp chất vòng lớn C15 có mùi xạ hương, các lactone C8 - C12 có hương hoa quả và hương béo ngậy (dừa, đào, dâu tây, mơ,…) [19]. Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để tác động đến đặc tính di truyền của các chủng, nhưng nguyên nhân tại sao một số chủng có khả năng tạo thành các hợp chất này thì vẫn chưa được hiểu rõ. Vì vậy, việc phân lập các chủng vi sinh vật mới, đặc biệt là nấm men có khả năng chuyển hóa sinh học chất béo thành các chất thơm để tìm hiểu con đường trao đổi chất, mức độ dị hóa, các chất trung gian tạo thành, hoạt tính β - oxy hóa,…Luôn luôn được các nhà khoa học chú trọng đặc biệt. Việc lựa chọn các chủng nấm men có tiềm năng để nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sinh chuyển hóa đạt hiệu quả cao nhằm ứng dụng trong ngành sản xuất chất thơm họ lactone như - decalactone là sự quan tâm lớn của các nhà khoa học.

Ngoài những ứng dụng chủ yếu trên đây, nấm men chuyển hóa chất béo còn có thể được sử dụng cho nhiều mục đích khác như sản xuất biodiesel, sản xuất axit citric, làm vi nang sinh học, xử lý ô nhiễm môi trường (nhất là môi trường bị ô nhiễm bởi chất thải chứa dầu như chất thải từ nhà máy chế biến dầu thực vật, từ các nhà máy sữa, môi trường đất ô nhiễm bởi dầu, bởi hạt có dầu và thực phẩm phân hủy) [16].

Trong sinh tổng hợp - decalactone, dầu thầu dầu được sử dụng làm nguồn cacbon duy nhất. Axit ricinoleic, thành phần chủ yếu của dầu thầu dầu đóng vai trò là nguồn cacbon chính cho sinh tổng hợp - decalactone. Sự có mặt của các axit béo trong dầu thầu dầu đóng vai trò là chất đồng oxy hóa và có tác dụng cảm ứng hệ enzyme. Với Yarrowia lipolytica W29, khi lượng dầu thầu dầu sử dụng tăng trong phạm vi nào đó thì sản lượng - decalactone thu được tăng dần, tuy nhiên nồng độ dầu sử dụng quá cao sẽ làm ức chế thậm chí ngừng quá trình sinh tổng hợp - decalactone [1].

Oxy là yếu tố rất quan trọng trong quá trình chuyển hoá sinh học axit ricinoliec trong dầu thầu dầu thành chất thơm γ-decalactone. Oxy hòa tan vào môi trường lỏng ở dạng bọt khí nhỏ làm kích thích sinh sản của nấm men và tạo điều kiện cho tế bào nấm men hô hấp. Oxy trong môi trường nuôi cấy không chỉ có vai trò kích thích sinh trưởng mà còn thúc đẩy sự sinh sản các enzyme ngoại bào, thúc đẩy sản sinh lipaza [16].

Để tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào nấm men và oxy chúng tôi đã sử dụng các biện pháp như: lắc, khuấy trộn hay thổi khí làm cho bọt khí càng phân tán nhỏ và đều hơn, do đó tế bào nấm men càng được tiếp xúc với chất dinh dưỡng và oxy tốt hơn. Ngoài ra còn có phương pháp bổ sung Perfluorodecalin như một nguồn mang oxy vào môi trường nuôi cấy.

pH môi trường

pH môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến tính háo nước và kỵ nước của thành tế bào nấm men, từ đó ảnh hưởng đến sự hấp thụ lipit của tế bào

Khi tiến hành lên men bằng chủng Yarrowia lipolytica W29 với nồng độ dầu thầu dầu 10g/L ở các pH khác nhau dao động từ 3 đến 7, khả năng tổng hợp - decalactone của chủng nấm men này tốt nhất ở pH bằng 7. Có thể ở pH này sự tạo thành các hạt lipit trong môi trường đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho sự tiếp xúc của chúng với tế bào nấm men, hoặc có thể tại pH này, tế bào nấm men sản sinh ra chất nhũ tương hóa giúp lipit hòa tan tốt trong canh trường [1].

Tốc độ lắc

Khi lên men bằng chủng Yarrowia lipolytica W29 trong môi trường chứa dầu thầu dầu ở nồng độ 10g/L, pH 7, với các tốc độ lắc khác nhau. Kết quả của Lại Thị Ngọc Hà cho thấy: tốc độ lắc phù hợp nhất cho sinh tổng hợp - decalactone là 200 vòng/phút [1].

Theo tác giả Lại Thị Ngọc Hà, khi tiến hành nuôi Yarrowia lipolytica W29 ở pH=7, tốc độ lắc 200 v/p và đo kính thước hạt lipit, kết quả thu được như sau:Trong một thí nghiệm, với Y. lipolytica W29, mà ở công thức đối chứng không có tế bào nấm men này, kết quả thu được như sau: ở công tức đối chứng, thời gian lắc càng lâu thì diện tích tiếp xúc riêng của hạt lipit càng lớn; trong khi đó ở công thức có nấm men, diện tích tiếp xúc riêng của các hạt lipit tương đối ổn định theo thời gian lắc. Điều này ủng hộ cho giả thiết rằng nấm men này có tiết ra một chất nhũ hóa làm ổn định trạng thái nhũ tương của môi trường [1]. Có lẽ chính vì thế mà thời gian lắc có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp - decalactone của nấm men này.

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học để sản xuất chất thơm bằng con đường sinh học như sinh tổng hợp hoặc sinh chuyển hóa còn rất ít.

Năm 1995-2000, dựa vào phản ứng ozon hóa từ dầu thầu dầu. Bùi Quang Thuật đã tổng hợp được các chất có giá trị cao như [R] -decalactone, [R] -undecalactone, diacetate [R]-1,4-decanodiol và khoảng 20 hợp chất thơm khác có hoạt tính quang học và sinh học, có thể sử dụng tốt trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm [4].

Năm 2003, trong khuôn khổ nhiệm vụ “Bảo tồn và lưu giữ nguồn gen vi sinh vật công nghiệp thực phẩm”, Viện Công nghiệp Thực phẩm lần đầu tiên đã tiến hành phân lập và khảo sát sơ bộ một số chủng nấm men có khả năng chuyển hóa dầu thầu dầu thành chất thơm. Từ các kết quả phân lập mới và khảo sát các chủng có sẵn trong sưu tập giống, nhóm đề tài đã tuyển chọn được 3 chủng nấm men có khả năng chuyển hóa axit ricinoleic từ dầu thầu dầu để tạo chất thơm trong quá trình nuôi cấy. Chất thơm đã được sơ bộ xác định thành phần bằng phương pháp sắc ký khí (GC), -decalactone tạo ra đã được sơ bộ định lượng và tách chiết. Hiệu suất tổng hợp -decalactone bằng các chủng nấm men của Viện Công nghiệp Thực phẩm đạt cao nhất là 0,24% (240 mg/L môi trường nuôi cấy) đối với chủng KFP 346 [3].

Năm 2003, Lại Thị Ngọc Hà, đã công bố kết quả nghiên cứu về một số yếu tố có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp -decalactone của chủng nấm men Yarrowia lipolytica W29. Ở điều kiện nuôi cấy trong phòng thí nghiệm với cơ chất dầu thầu dầu 20 g/L, pH=7,0, tốc độ lắc 200 vòng/phút, chủng nấm men này tổng hợp được 621mg -decalactone/lít môi trường [1].

b. Ngoài nước

Nhu cầu về chất thơm sử dụng trong các lĩnh vực chế biến thực phẩm, đồ uống, mỹ phẩm, dược phẩm và chất tẩy rửa đạt khoảng 16-20 tỷ đô la Mỹ hàng năm nhưng vẫn chủ yếu là các chất thơm được tổng hợp hóa học và chỉ rất ít trong chúng được sản xuất bằng con đường tách chiết từ thực vật hoặc qua sự trao đổi chất của vi sinh vật.

- lactone và -lactone là thành phần chủ yếu tạo nên hương thơm của các nguồn hương tự nhiên như các loại quả và một số sản phẩm lên men. Hương thơm của các lactone là do cấu trúc vòng lactone quyết định, độ dài của mạch cacbon và cấu trúc đồng phân quang học. - decalactone, chất hương có giá trị lớn trong nhiều ngành công nghiệp và cho đến nay là chất thơm chính được tổng hợp bằng con đường sinh học. Sản lượng -decalactone càng ngày càng tăng, dẫn đến giá thành giảm dần. Năm 1997, sản lượng -decalactone đạt 10 tấn làm giảm giá thành đáng kể từ trên 12.000 đô la Mỹ/kg (năm 1986) xuống còn 500 đô la Mỹ/kg năm 1998 và 300 đô la Mỹ/kg năm 2003. Các nhà sản xuất chất thơm rất quan tâm đến việc hạ giá thành sản xuất và điều này đã dẫn tới sự thay đổi trong định hướng nghiên cứu ở lĩnh vực này [20].

Một số kết quả nghiên cứu khoa học về chuyển hóa cơ chất tạo thành chất thơm dạng lactone nhờ sử dụng vi sinh vật đã được thống kê như sau:

Farbood và Willis (1985) sử dụng các chủng nấm men Yarrowia lipolytica, Aspergillus oryzae, Geotrichum klebahnii và Candida sp. Để tổng hợp -decalactone từ các cơ chất chính là dầu thầu dầu, dầu thầu dầu cùng với enzyme lipase, dầu thầu dầu thủy phân ở quy mô phòng thí nghiệm trong các bình tam giác có khuấy. Tuy nhiên, hiệu suất thu được còn thấp, chỉ đạt 0,69g/L môi trường sau 1 tuần nuôi cấy [17].

Trong một nghiên cứu gần đây, Alchihab M và cộng sự (2010) đã sử dụng các chủng nấm men Rhodotorula aurantiaca phân lập từ Nam Cực để lên men dầu thầu dầu tạo -decalactone. Nồng độ γ-decalactone cao nhất đạt 5,8g/L trên môi trường chứa 20g/L dầu thầu dầu [8].

Nồng độ γ-decalactone tích tụ trong canh trường cao nhất hiện nay (12,3 g/L) được ghi nhận bởi nhóm tác giả Đức thực hiện trên Yarrowia lipolytica HR 145 (DSM 12397), môi trường chứa 0,5% ure, khoáng chất, vitamin, 0,07% Tween 80, và 5% dầu thầu dầu, sau khi đã tối ưu hóa điều kiện lên men. Kỹ thuật này đã được đăng ký bản quyền công nghệ bởi công ty Haarmann & Reimer GmbH [33].

Groguenin và cộng sự năm 2004, sau khi xác định được các đặc tính của một số enzyme của con đường β - oxy hóa trong nấm men Yarrowia lipolytica, đã nghiên cứu loại bỏ một số enzime hoạt động trong quá trình chuyển hóa chuỗi ngắn. Khi loại bỏ được các enzyme này, đã nâng cao được hiệu suất chuyển hóa và tích lũy các hợp chất hương thơm lớn hơn 4 lần [24].