DẦu thầu dầu bằng nấm men yarrowia lipolytica luận văn thạc sĩ khoa họC

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Số liệu được trình bày trong bảng 3.2 cho thấy: pH 6,0 là thích hợp nhất cho Y- lipolytica VTP5 sinh trưởng và chuyển hóa dầu thầu dầu thành chất thơm γ-decalactone, với lượng sinh khối ướt và γ-decalactone đạt giá trị cao nhất, tương ứng là 48,5 g/L và 2,286 g/L sau 4 ngày nuôi cấy.

Mỗi chủng nấm men đều có pH môi trường thích hợp riêng cho sự tổng hợp γ-decalactone. Có thể ở điều kiện pH này, tế bào nấm men sản sinh ra một chất nhũ tương hóa giúp lipit hòa tan tốt trong canh trường. Điều này đã được Pagot cùng cộng sự đã đề cập. Theo họ, khi hạt lipit đạt kích thước nhỏ nhất, diện tích tiếp xúc riêng của chúng là lớn nhất, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tiếp xúc với tế bào nấm men, giúp cho sự trao đổi chất tạo sản phẩm thứ cấp trong tế bào diễn ra nhanh hơn, mạnh hơn [31].

Trong quá trình nhân giống cấp 1, ở điều kiện lắc 200 v/p, nhiệt độ 27^oC thì đạt mật độ cao nhất sau 9 giờ tuổi, ở mức 6,5 x 10⁶ tế bào/mL (bảng 3.3) từ thời điểm 12 giờ trở đi, hầu hết tế bào ở dạng khuẩn ty, vì thế chúng tôi không thể xác định được mật độ tế bào theo phương pháp đếm trong buồng đếm hồng cầu trong luận văn này. Tuy nhiên, việc nhân giống cấp 1, với thời gian lâu hơn 9 giờ để có thể có được mật độ tế bào cao hơn 6,5 x 10⁶ tế bào/mL là không kinh tế vì tiêu tốn thêm thời gian và năng lượng.

Cũng theo trong bảng 3.4, ở tỷ lệ giống 15% thì lượng sản phẩm giảm xuống, còn lượng sinh khối thì tăng lên so với tỷ lệ giống 10%, lượng sản phẩm tiếp tục giảm khi tỷ lệ giống tăng lên 20%, còn sinh khối cũng giảm. Những hiện tượng này có thể được giải thích rằng, so với tỉ lệ giống 10% thì tỷ lệ giống 5% chưa đủ tạo ra lượng sinh khối cần thiết để tạo nhiều sản phẩm; tỷ lệ giống 15% tạo ra quá nhiều sinh khối khiến chúng phân hủy (tiêu dùng) một phần sản phẩm đã tạo ra; và với tỷ lệ giống 20% thì lượng sinh khối sinh ra phải giảm xuống vì cơ chất không đủ cho chúng, mặc dù chúng đã tiêu thụ một phần sản phẩm.

Kết quả trình bày trong bảng 3.5 cho thấy, với các điều kiện lên men đã lựa chọn trong mục 3.1.1- 3.1.4, chủng Y. lipolytica VTP5 có khả năng tổng hợp lượng γ-decalactone ở mức cao nhất là 2,835 g/L sau 4 ngày lên men. Tới ngày thứ 5, lượng sản phẩm giảm xuống, có thể là do bị tiêu dùng một phần bởi các tế bào.

Theo một số nghiên cứu đã được công bố, để giảm bớt ảnh hưởng kìm hãm của ricinoleic acid/methyl ricinoleate trong dầu thầu dầu đến sự sinh trưởng của nấm men chuyển hóa dầu này thành γ-decalactone, các tác giả đã sử dụng phương pháp lên men 2 pha [39][41], hoặc phương pháp lên men tiếp dần cơ chất (fed – batch) [34]. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu sử dụng phương pháp thứ hai này, theo đó có 3 công thức thí nghiệm: môi trường ban đầu chứa 20, 40, 60 g dầu thầu dầu/L, sau 24 giờ lên men, được tiếp thêm lượng dầu thầu dầu còn lại. Ở công thức đối chứng, môi trường chứa 100 g dầu thầu dầu/ L ngay từ ban đầu.

Kết quả trong bảng 3.6 cho thấy phương thức lên men tiếp dần cơ chất đã nâng cao hiệu suất lên men của Y. lipolytica VTP5; ở cả 3 công thức thí nghiệm lượng sinh khối và lượng sản phẩm đều tăng so với ở công thức đối chứng riêng ở công thức “40+60” cả lượng sinh khối và lượng sản phẩm đều đạt mức cực đại so với các công thức khác.

Kết quả nghiên cứu chứng tỏ dầu thầu dầu có ảnh hưởng ức chế đến sự sinh trưởng của nấm men, thông qua đó làm giảm lượng γ-decalactone thu được nhờ lên men. Phương pháp fed-batch có hiệu quả tốt ở quy mô máy lắc như vừa trình bày, sẽ được ứng dụng ở quy mô nồi lên men 5L và 50L trong các phần tiếp theo.

Trong Bảng 3.7 có nêu lên các thông số đã được lựa chọn một cách riêng lẻ (trong khi cố định các thông số khác) để đạt được lượng sản phẩm cao nhất. Các thông số đã được lựa chọn này sẽ được áp dụng tiếp tục cho lên men ở quy mô 5L và 50L.

Các điều kiện lên men cơ bản gồm: nồi lên men có dung tích 5L (dung tích làm việc 3L), môi trường chứa 100 g/L (10%) dầu thầu dầu, tỷ lệ giống cấp 1 là 10%, tốc độ khuấy 200 vòng/phút, cấp khí 0,7 L/L môi trường/phút, nhiệt độ 27^oC. Với phương thức lên men “không khống chế pH và DO”, kết quả (Hình 3.1) cho thấy:

- Môi trường lên men sau khi thanh trùng có pH 5,42. Trong 8 giờ đầu pH giảm nhẹ xuống 5,02; sau đó tăng nhanh, đạt giá trị cao nhất là 7,0 ở 24 giờ lên men, rồi giảm dần đến 4,53 khi kết thúc lên men ở 96 giờ.

- Hàm lượng ôxy hòa tan trong môi trường đạt 75,3% khi bắt đầu lên men, giảm nhanh xuống 5% sau 16 giờ, sau đó giảm nhẹ dần và giữ ở 0,2% từ 64 giờ cho đến khi kết thúc lên men ở 96 giờ. Điều này cho thấy nấm men Y. lipolytica VTP5 sinh trưởng và tiêu thụ ôxy với mức độ cao.

- Sinh khối nấm men tăng nhanh, đạt giá trị cao nhất là 5,31 gam sinh khối ướt/100 mL (53,1 g/L) ở 48 giờ, sau đó giảm nhẹ còn 4,85 g/100 mL khi kết thúc lên men.

- γ-decalactone bắt đầu được tích tụ trong môi trường lên men sau 24 giờ, tăng dần và đạt giá trị cao nhất là 4,264 g/L sau 88 giờ lên men, sau đó giảm còn 3,920 g/L khi kết thúc lên men ở 96 giờ. Không có hiện tượng tế bào nấm men bị chết khi nồng độ γ-decalactone trong môi trường nuôi cấy tăng dần.

Như vậy, khi lên men theo mẻ ở nồi lên men dung tích 5L, theo phương thức “không khống chế pH và DO”, hiệu suất chuyển hóa sinh học dầu thầu dầu thành γ-decalactone tăng 50% (đạt 4,264 g/L) so với lên men trên máy lắc (2,835 g/L). Sinh khối tế bào nấm men tăng không nhiều so với khi nuôi cấy trên máy lắc. Tuy nhiên, thời gian lên men vẫn kéo dài.

Lượng sản phẩm tăng lên như trên, so với lên men trên máy lắc có thể liên quan đến tác dụng tốt của sự khuấy, sục khí: tính chất nhũ hóa và sự tương tác trong các pha môi trường lỏng của dầu và nước được cải thiện, khiến dầu tiếp xúc tốt hơn với tế bào để được chuyển hóa thành sản phẩm. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nhiều công trình của các tác giả khác [7].

Để nâng cao hơn nữa hiệu suất chuyển hóa dầu thầu dầu thành γ-decalactone, chúng tôi tiếp tục các nghiên cứu các phương thức lên men khác nhau như trong các phần dưới đây.

Theo phương thức này, kết quả nêu trong hình 3.2 A cho thấy :

+ DO trong môi trường lúc đầu đạt 97,5%, giảm xuống 48,2% sau 8 giờ lên men. Sau đó để giữ cho hàm lượng DO trong môi trường có giá trị khoảng 40%, tốc độ cánh khuấy được tăng lên và dao động trong khoảng 300 - 500 vòng/phút.

+ Sinh khối nấm men tăng nhanh, đạt 5,58 gam sinh khối ướt/100 mL sau 40 giờ lên men và tiếp tục tăng nhẹ đến 6,30 g/100 mL và giữ ở mức này cho đến khi kết thúc lên men ở 96 giờ.

+ Lượng γ-decalactone đạt 5,22 g/Lít sau 72 giờ nuôi cấy, tăng 22,4% so với phương thức khi lên men không điều chỉnh pH môi trường ban đầu và không khống chế DO (4,264 g/L).

3.2.1.3. Lên men theo phương thức Batch culture “có khống chế pH và DO”

+ Sinh khối đạt mức cao nhất 7,88-7,85 g/100mL trong khoảng 56 đến 64 giờ lên men, tăng 24,3% so với phương thức “không khống chế pH có khống chế DO” (6,30g/100mL), sau đó giảm nhẹ đến 7,55g/100mL ở thời điểm 96 giờ (kết thúc lên men).

+ Lượng γ-decalactone đạt 6,234 g/L sau 64 giờ lên men, tăng 46% so với ở phương thức không khống chế pH và có khống chế DO (5,22 g/L).

Như vậy, trong phương thức này, nhờ sự tăng lượng không khí vào môi trường để cố định và khống chế hàm lượng ôxy hòa tan, mà sự sinh trưởng của nấm men mạnh hơn và hàm lượng γ-decalactone cũng tăng theo. Hơn nữa, khi khống chế hàm lượng ôxy hòa tan, trong cả hai trường hợp không khống chế và có khống chế pH môi trường ở giá trị thích hợp, lượng sản phẩm γ-decalactone đều tăng, và thời gian lên men được rút ngắn đáng kể so với phương thức Batch culture (không khống chế pH và DO mục 3.2.1.1).

Trong phương thức lên men này, một số điều kiện lên men được áp dụng từ các kết quả lựa chọn điều kiện lên men trên máy lắc (mục 3.1) như: nồng độ ban đầu của dầu thầu dầu trong môi trường là 40g/L, sau 16 giờ lên men được tiếp thêm 60g/L với tốc độ 2ml/phút; không khống chế pH ở 6 và DO ở 40%.

Kết quả trình bày trong hình 3.3 cho thấy:

- Sinh trưởng của nấm men diễn ra nhanh hơn trong 16 giờ lên men đầu tiên so với lên men theo mẻ sử dụng môi trường chứa toàn bộ dầu thầu dầu 100g/L ngay từ đầu (hình 3.2). Như vậy phương thức fed-batch culture có lẽ đã giảm bớt sự kìm hãm của cơ chất đối với sinh trưởng của nấm men. Sinh khối tế bào đạt cực đại 8,0 gam sinh khối tươi/100 mL môi trường sau 56 giờ lên men và giữ nguyên giá trị này đến khi kết thúc lên men ở 112 giờ.

- γ-decalactone bắt đầu được được tích tụ ở mức 0,254 g/L tại thời điểm 12 giờ lên men, sớm hơn so với nuôi cấy theo mẻ (24 giờ ở hình 3.2) và tăng dần, đạt 7,343 gam/Lít sau 96 giờ lên men rồi giữ nguyên không thay đổi đến 112 giờ.

Hình 3.3. Động học quá trình lên men theo phương thức Fed-batch culture, có khống chế pH và DO, ở quy mô 5L

Như vậy, với phương thức lên men theo mẻ có tiếp dần cơ chất dầu thầu dầu, cả sự sinh trưởng của nấm men và sự chuyển hóa dầu thầu dầu thành γ-decalactone đều tăng so với nuôi cấy theo mẻ (Bảng 3.8). Ngoài ra, sau khi đạt giá trị cực đại, γ-decalactone không bị phân hủy/(tiêu thụ) bởi nấm men, mặc dù lượng sinh khối không suy giảm (xem hình 3.3 so với hình 3.1 và 3.2). Theo phương thức fed-batch culture, mặc dù thời gian lên men có dài hơn (để đạt tới lượng sản phẩm cực đại), nhưng điều quan trọng là lượng này cao hơn nhiều so với của 3 phương thức batch culture (bảng 3.8). Hơn nữa, như vừa đề cập trên đây, sau khi γ-decalactone đạt mức cực đại, mức này được giữ cho đến thời điểm kết thúc lên men (112 giờ). Dường như phương thức lên men này có tác dụng bảo vệ cho sản phẩm lên men không bị phân hủy. Nhận định này phù hợp với các tài liệu [22] và [27].

Bảng 3.8. So sánh kết quả lên men theo 4 phương thức, trên thiết bị dung tích 5 lít.

Các nghiên cứu được thực hiện trên nồi lên men dung tích 50L (B.E. Marubishi, Nhật Bản). Có tốc độ khuấy cao nhất là 250 vòng/phút, không khống chế được pH và DO. Trên thiết bị này, sự lên men được nghiên cứu dưới 2 phương thức lên men là lên men theo mẻ và lên men theo mẻ có tiếp dần cơ chất.

Các diễn biến về pH môi trường lên men, sinh khối, và lượng γ-decalactone tạo thành được thể hiện ở (hình 3.4 A) và được mô tả như sau:

- Sinh khối tế bào tăng nhanh trong 16 giờ đầu nuôi cấy, đạt 3,72 gam sinh khối ướt/100 mL, sau đó tăng đến 7,5 g/100 mL trong thời gian 44-52 giờ và giảm nhẹ còn 7,35 g/100 mL khi kết thúc lên men ở 64 giờ.

- γ-decalactone được tích tụ sau 12 giờ nuôi cấy, tăng dần và đạt giá trị cao nhất 7,204 g/L ở 56 giờ, sau đó giảm xuống 6,54 g/L khi kết thúc lên men ở 64 giờ.

Như vậy, khi lên men theo mẻ trên nồi 50 lít, hiệu suất lên men tăng 16%, thời gian ngắn hơn 8 giờ so với lên men theo mẻ ở quy mô 5L có khống chế pH và DO (7,204 g/L sau 56 giờ so với 6,234 g/L sau 64 giờ xem thêm hình 3.2 B và bảng 3.8). Tuy nhiên, theo phương thức này mặc dù ở quy mô 50L, lượng sản phẩm vẫn thấp hơn so với phương thức Fed-batch culture (quy mô 5L), (7,240 so với 7,343 g/L), bởi vậy, phương thức Fed-batch culture được áp dụng cho quy mô 50L như dưới đây.

Phương thức lên men này được thực hiện trong nồi lên men 50L (dung tích làm việc 30 L) với 40% lượng dầu thầu dầu (1200 gam) được đưa vào môi trường nuôi cấy từ đầu, và được bổ sung 60% (1800 gam) dầu thầu dầu sau 16 giờ lên men, với tốc độ 20 mL/phút, tốc độ khuấy 200 vòng/phút, cấp khí 1,0 L không khí/L môi trường/phút, lượng giống 10%. Những sự kiện chính của quá trình lên men này như sau (hình 3.4 B):

- pH ban đầu là 5,96, giảm dần đến 4,04 khi kết thúc lên men ở 64 giờ.

- Lượng sinh khối tăng rất nhanh, đạt 5,97 g/100 mL dịch lên men sau 20 giờ và tăng dần tới mức cao nhất 8,1 g/L tại 56 giờ, giảm không đáng kể tới 8,0 g/L đến khi kết thúc lên men ở 64 giờ.

- Lượng γ-decalactone tích tụ trong môi trường là 0,33 g/L sau 12 giờ lên men, tăng dần đến 8,10 g/L sau 60 giờ và giữ nguyên giá trị này khi kéo dài thời gian lên men thêm 4 giờ.

Như vậy, khi lên men theo phương thức fed-batch culture ở quy mô pilot 50L, mặc dù trong điều kiện không khống chế được pH và DO, lượng γ-decalactone tạo thành vẫn tăng, tuy không nhiều, so với ở quy mô 5L {8,1 g/L so với 7,34 g/L (xem thêm bảng 3.9)} và đặc biệt với thời gian ngắn hơn nhiều (60 giờ so với 96 giờ, xem thêm hình 3.3). Điều đó chứng tỏ việc khuấy trộn và cung cấp không khí trong các thiết bị lên men dung tích lớn hơn là yếu tố có ảnh hưởng rất tích cực đối với sự chuyển hóa sinh học dầu thầu dầu thành γ-decalactone của chủng nấm men Y. lipolytica VTP5.

(A)	(B)
Hình 3.4. Động học quá trình lên men ở quy mô 50L, theo phương thức Batch culture (A) và Fed-batch culture (B)

Cũng trong sự so sánh Fed-batch culture với Batch culture ở cùng quy mô 50 Lít, thì thời gian để đạt lượng sản phẩm cực đại là không dài hơn nhiều (60 giờ so với 56 giờ).

Kết quả trên đây của chúng tôi cũng cho thấy đây là phương thức lên men có hiệu quả khi sản xuất γ-decalactone ở quy mô lớn và phù hợp với kết quả của Rabenhorst và Gatfield (2012). Theo các tác giả này, lên men bằng chủng Y. lipolytica HR 145 trên môi trường ban đầu chứa 10 g/L ricinoleic acid, sau 16 giờ bổ sung 50 g/L, thì lượng γ-decalactone đạt 11,0 và 12,3 g/L tại thời điểm 69 và 70 giờ trên thiết bị lên men 10L và 300L [34].