BỘ giáo dục và đÀo tạo trưỜng đẠi học cần thơ khoa khoa học -viện nc&pt công nghệ sinh họC

tải về 1.3 Mb.

trang	7/7
Chuyển đổi dữ liệu	23.08.2016
Kích	1.3 Mb.
	#27779

1 2 3 4 5 6 7

Xác định hàm lượng protein:
Dựa vào tỷ lệ Nitơ tương đối trong thành phần protein để xác định hệ số protein. Hàm lượng nitơ toàn phần trong protein động vật khoảng 16 %, khi đó hệ số protein K là: K = 100/16 = 6,25
Hàm lượng protein tổng số (CP) được tính theo công thức:
% protein tổng số = %N * K
4. Kết quả xác định đạm tổng số của bột trùn quế đông khô.

	Lần 1	Lần 2	Trung bình
Nitơ tổng số (%)	11,13	11,04	11,09
Protein tổng số (%)	69,58	69,01	69,30

II. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford
1. Nguyên tắc: Khi Coomassie Brilliant Blue G 250 kết hợp với protein, thuốc nhuộm thay đổi màu từ hơi đỏ sang xanh xanh và hấp thụ cực đại ở bước sóng từ 465nm đến 595nm. Sự thay đổi hấp thụ ở 595nm tương ứng với nồng độ protein có trong mẫu.

2. Tiến hành:
a. Chuẩn bị dung dịch Bradford: Hòa tan 100mg Coomassie Blue G250 trong
50ml ethanol 95%. Sau đó cho thêm 100ml acid phosphoric 85% khuấy đều. Bổ sung thêm nước cất cho đến một lít. Sau đó lọc bằng giấy lọc Whatman N^o1và trữ trong chai tối ở nhiệt độ phòng. Thuốc thử có thể sử dụng trong hai tuần nhưng trong thời gian này thuốc thử có thể bị tủa nên khi sử dụng cần phải lọc lại.
b.Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn: Cân 3mg BSA, hòa tan trong 3ml nước cất. Ta thu được dung dịch BSA mẹ có nồng độ 1mg/ml. Giữ ở -20^oC.
c. Xây dựng đường chuẩn
Chuẩn bị dãy protein BSA chuẩn với nồng độ tăng dần từ 0, 30, 60, 120, 180,
240, 300 µg/ml.
Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
_{Chuẩn bị các ống nghiệm và thêm vào các chất theo bảng sau :}

Ống nghiệm

[BSA]( µl)

120

180

240

300

V buffer (H₂O cất)
(µl)

1000

970

940

880

820

760

700

Lắc đều các ống.
Lấy 100 µl dung dịch từ các ống nghiệm trên cho vào một dãy ống nghiệm được đánh số tương tự.
Cho vào mỗi ống 2 ml thuốc thử.
Lắc đều ống bằng máy vortex. Tránh để có bọt. Sau 10 phút tiến hành đo OD.

Định chuẩn máy quang phổ với dung dịch đệm (ống 1) ở bước sóng 595nm. Chỉnh OD về giá trị 0. Tiến hành đo các ống còn lại.

Ghi nhận kết quả.
Tính giá trị trung bình 3 lần lặp lại thí nghiệm.
Vẽ biểu đồ đường chuẩn BSA thể hiện mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 595nm
d. Định lượng protein có trong mẫu :
Hàm lượng protein có trong mẫu cũng được tiến hành đo đồng thời với việc dựng đường chuẩn. Cũng lấy 10 µl và cho vào 2 ml thuốc thử.
Ghi nhận kết quả, lấy giá trị trung bình của 3 ống
Từ phương trình đường chuẩn ta suy ra được hàm lượng protein trong dung dịch
đo.
_{3. Kết quả xây dựng đường chuẩn BSA.}

BSA

(ug/ml)

120

180

240

300

595nm

0,001

0,069

0,187

0,354

0,51

0,654

0,757

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0

Đường chuẩn BSA
y = 0.0026x + 0.0174

R²= 0.9919

0 50 100 150 200 250 300 350

Nồng độ BSA (ug/ml)

III. Xác định hàm lượng đạm amin bằng phương pháp OPA
1. Nguyên tắc

Các nhóm amin của acid amin hoặc peptide phản ứng với ortho-phthaldialdehyde với sự có mặt của -SH của dithiothreitol (DTT) hoặc -mercaptoethanol sẽ tạo ra hợp chất có khả năng hấp thụ ở bước sóng 340 nm.

2. Tiến hành
* Pha dung dịch OPA:
+ Dung dịch 1: 25,4 g Borax + 667 mg SDS + nước cất = 500 ml.
+ Cân chính xác 40 mg OPA pha trong 1 ml etanol để hòa tan hết, thêm vào 44 mg dithiothreitol (DTT), sau đó thêm 37,5 ml dung dịch 1 rồi pha thành 50 ml ta được dung dịch OPA (chỉ pha trước khi dùng).
* Pha serine chuẩn: Cân 10 mg serine pha trong bình định mức 100 ml được nồng độ 0,1 mg/ml.
* Đo mẫu :

+ 200 l dd serine chuẩn + 1,5 ml OPA

+ 200 l nước + 1,5 ml OPA.

+ 200 l dd thủy phân đã pha loãng + 1,5 ml OPA, rồi để yên 2 phút, đem đo ở bước sóng 340 nm

3. Tính kết quả
_{Hàm lượng đạm amin được tính theo công thức:}

V_S

^M_N₌^C_S^x

14,2 x

x 100

(mgN/g)

1000 m
Trong đó :
^M_N^:^h^à^m^l^ư^ợ^ng^đ^ạ^m^a^mⁱⁿ

C_S=

OD_S– OD_O
OD_S_D– OD_O

x 0,9516 (mMol/L)

0,9516: mMol/L Serine (tương đương 0,9516 Mmol/L Nitơ)
V_S: Thể tích dịch thuỷ phân (ml)
m: khối lượng mẫu(g)
100: hệ số pha loãng .
^OD_S_D^,^O^D_S^,^OD_O^:độ^hấp^thụ³⁴⁰^nm^m^ẫu^chuẩn^serine,^m^ẫu^thật,^m^ẫu^k^hôⁿ^g

Hiệu suất thuỷ phân (N%) =

M_Nx100
^M_N_t_ổ_n_g_s_ố

Trong đó :

N: hiệu suất thuỷ phân (%).
M_N: đạm amin trong dịch thủy phân.
M_N_t_ổ_n_g_s_ố: đạm amin tổng số

tải về 1.3 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:

1 2 3 4 5 6 7