BỘ giáo dục và đÀo tạo trưỜng đẠi học cần thơ khoa khoa học -viện nc&pt công nghệ sinh họC

tải về 1.3 Mb.

trang	3/7
Chuyển đổi dữ liệu	23.08.2016
Kích	1.3 Mb.
	#27779

1 2 3 4 5 6 7

2. Ngoài nước

Nielsen P.M. el al

. Kết quả cho thấy phương pháp OPA dễ thực hiện, cho kết quả nhanh và chính xác hơn, phạm vi áp dụng rộng hơn và ít độc hại hơn so với phương pháp TNBS (trinitro-benzene-sulfonic acid).

_{Hrčková Martina et al}

_{nhau: Flavourzyme, Novozym và Alc}

5% bằng ba enzyme protease khác

(19%),

(12,9%).

Salem F. M. A. et al. (1995) đã sử dụng tỷ lệ là 0,3% enzyme so với cá gồm papain, trypsin, ficin và bromelain thêm vào cùng với 25% muối ngay từ đầu quá trình sản xuất nước mắm trên năm loại cá (sardine, macaroni, bolti, bourri và shark). Kết quả cho thấy với 0,3% papain cho hàm lượng đạm tổng số cao nhất so với các enzyme còn lại trên mẫu cá mòi (sardine) sau 180 ngày lên men và cao hơn so với mẫu đối chứng lên men cổ truyền là 30%.

Aspmo Stein Ivar et al

_{của nó hoặc bổ sung một trong số bảy enzyme protease thương mại}

.
Nakajima Nobuyoshi et al

Lumbricus rubellus.

.

PHẦN III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I. Phương tiện nghiên cứu
Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ enzyme - Viện
Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học
1. Nguyên liệu
Trùn quế đã đông khô trữ lạnh ở -20^oC.
2. Thiết bị và dụng cụ
Một số thiết bị như: tủ ủ (Ehret), máy quang phổ kế (U-1500, Hitachi), máy ly tâm (Centaur 2, U.K), máy khuấy từ (Heidolph, Germany), máy đo pH (inoLab), bếp điện, cân phân tích, buồng cấy vi sinh vật, máy lắc ủ (Heidolph, Germany), nồi khử trùng.…..
Một số dụng cụ như: bình tam giác, dĩa petri, beaker, bình định mức, ống đong, ống nghiệm, micropipet, que cấy…

3. Hóa chất
BSA (Biovin Serum Albumin) (Merck), NaCl (Merck), Borax (Disodium tetraborate) (TQ), SDS (Sodium dodecyl sulfat) (Merck), OPA (Ortho- phthaldialdehyde) (Merck), DTT (Dithiothreitol) (Merck), Serine (Merck), Ethanol (Merck), HCl (Merck), Coomassie Blue G-250 (Merck), Acid phosphoric 85% (Merck).
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: pepton (Hà Lan), dịch chiết thịt bò, dịch chiết nấm men, agar, natri clorua, đường…
- Môi trường Luria Broth (LB): Pepton 10 gam Yeast extract 5 gam NaCl 10 gam

Agar 15-20 gam (nếu dùng môi trường đặc)

Pha hỗn hợp trong nước và chỉnh pH 7,2.
- Môi trường nuôi cấy nấm men (YEB): Dịch chiết thịt bò 5 gam

Dịch chiết nấm men 1 gam Pepton 5 gam Đường 5 gam

Pha hỗn hợp trong nước và chỉnh pH = 6
Môi trường đạm dịch trùn quế thủy phân được tính để thay thế dựa trên lượng đạm amin của 10 hoặc 5 gam pepton tùy theo môi trường nuôi cấy.

II. Phương pháp nghiên cứu
1. Chuẩn bị mẫu và xác định thành phần đạm nguyên liệu

a. Chuẩn bị mẫu
- Sử dụng trùn quế đã rửa sạch, sấy đông khô (độ ẩm < 5%) và trữ lạnh ở -20^oC. Đem xay mịn bằng máy xay sinh tố rồi tiến hành tự thủy phân với các điều kiện tối ưu cho quá trình tự thủy phân đã được nghiên cứu theo Phạm Thị Quỳnh Trâm (2008).

- Tiến hành: Cân 26,52 gam trùn quế sấy đông khô đã xay mịn, bổ sung 173,48 ml nước cất, dịch thủy phân đạt nồng độ protein 9%. Thuỷ phân trong 24 giờ ở nhiệt độ 55^oC.

Cân lượng pepton Hà Lan (độ ẩm < 6 %) tương đương trùn quế sấy đông khô pha trong cùng lượng nước cất. Tiến hành xác định hàm lượng protein hòa tan và đạm amin.

b. Xác định thành phần đạm nguyên liệu
Hàm lượng đạm tổng số
Phương pháp: dùng phương pháp Kjeldahl (Phụ lục 1)
Hàm lượng protein hòa tan
Phương pháp: đo hàm lượng protein nguyên liệu theo phương pháp Bradford
(Phụ lục 2)
Hàm lượng đạm amin

Phương pháp: Xác định theo phương pháp OPA (Nielsen et al, 2001). (Phụ lục 3)

2. Sử dụng sản phẩm thủy phân của trùn quế để nuôi vi sinh vật
a. Thí nghiệm 1: Xác định lượng đạm amin của trùn quế thay thế đạm amin của pepton thích hợp môi trường nuôi cấy vi khuẩn E. Coli DH 5

- Mục đích: Chọn lượng đạm amin trùn quế thích hợp để thay thế lượng pepton trong môi trường LB nuôi cấy chủng vi khuẩn E. Coli DH 5 . Đây là chủng vi khuẩn được dùng trong công nghệ gen và hiện đang sử dụng tại phòng Công nghệ gen thực vật thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại Học Cần Thơ.

- Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại. Nhân tố A: lượng đạm amin thay thế pepton với 5 mức độ:

A₁= 0%	A₂= 25%	A₃= 50%
A₄= 75%	A₅= 100%

- Tiến hành: Vi khuẩn E. coli DH 5được nuôi trong môi trường Luria Broth. Pepton và dịch đạm trùn quế được xác định hàm lượng đạm amin bằng phương pháp OPA (Nielsen, 2001) để quy về lượng đạm amin như nhau giữa các nghiệm thức từ A1 đến A5. Sau đó chủng 0,1% (v/v) vi khuẩn E. coli DH 5 . Tiến hành ủ ở 37^oC với tốc độ lắc là 110 vòng/ phút. Sau 16 giờ tăng trưởng sẽ đo độ đục ở bước sóng 600nm (OD_600n_m) để xác định mức độ tăng trưởng của vi khuẩn trên các nghiệm thức.

Kết quả: Chọn được lượng bột đạm thích hợp để tiến hành thí nghiệm 2.
b. Thí nghiệm 2: Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn E. Coli DH 5theo thời
gian
Môi trường lỏng
- Mục đích: Chọn được thời gian thích hợp để chủng vi khuẩn E. Coli DH 5sinh trưởng tốt nhất trong môi trường có lượng đạm amin thay thế đã chọn từ thí nghiệm 1 và so sánh sự tăng trưởng của vi khuẩn E. coli DH 5theo thời gian trên hai môi trường đạm pepton và đạm thay thế.

- Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại. Nhân tố B: Thời gian nuôi cấy với 9 mức độ:
B₁= 3 giờ B₂= 6 giờ B₃= 9 giờ B₄= 15 giờ B₅= 18 giờ B₆= 21 giờ B₇= 24 giờ B₈= 27 giờ B₉= 30 giờ

- Tiến hành: Vi khuẩn cũng được chủng 0,1% (v/v) vào môi trường Luria Broth. Và nuôi trên máy lắc ủ, 110 vòng/phút, nhiệt độ 37^oC. Mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp lại. Cứ sau 3 giờ kể từ khi bắt đầu chủng vi khuẩn cho đến 30 giờ, lấy 1,5ml cho vào eppendorf, trữ ở 4^oC để tiến hành đo độ đục ở OD_600n_m.

Môi trường thạch đĩa.

- Mục đích: Quan sát và so sánh sự phát triển của khuẩn lạc E. coli DH 5 theo

thời gian trên 2 môi trường đạm pepton và đạm trùn quế thay thế.

- Tiến hành: Môi trường thạch đĩa có thành phần giống môi trường lỏng (Luria Broth) nhưng có thêm agar 2%. Dùng que cấy chuyển vi khuẩn E.coli DH 5 lên đĩa trong điều kiện vô trùng và ủ ở 37^oC. Quan sát và chụp hình khuẩn lạc của vi khuẩn sau 16, 24, 36 giờ.

c. Thí nghiệm 3: Xác định lượng đạm amin thay thế pepton thích hợp môi trường YEB nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae
- Mục đích: Chọn lượng đạm amin trùn quế thích hợp để thay thế lượng pepton trong môi trường YEB nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae. Đây là chủng nấm men được sử dụng lên men rượu phổ biến và hiện đang sử dụng tại phòng Vi sinh thực phẩm thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại Học Cần Thơ.

- Bố trí thí nghiệm:

C₁= 0%	C₂= 25%	C₃= 50%
C₄= 75%	C₅= 100%

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại. Nhân tố C: lượng đạm amin thay thế pepton với 5 mức độ.

- Tiến hành: Chủng 0,1%(v/v) nấm men vào các bình tam giác 100ml có chứa môi trường nuôi cấy nấm men với hàm lượng đạm amin bằng nhau giữa các nghiệm thức. Ủ lắc ở 30^oC, 110vòng/phút. Sau 24 giờ phát triển, tiến hành đo độ đục môi trường nuôi ở OD₆₀₀_n_m.

d. Thí nghiệm 4: Theo dõi sự phát triển của Saccharomyces cerevisiae theo
thời gian
Môi trường lỏng
- Mục đích: Chọn được thời gian thích hợp để chủng nấm men YEB sinh trưởng tốt nhất trong môi trường có lượng bột đạm thay thế đã chọn từ thí nghiệm 3.
- Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại
Nhân tố D: Thời gian nuôi cấy với 9 mức độ:

D₁= 3 giờ D₂= 6 giờ D₃= 9 giờ D₄= 15 giờ D₅= 18 giờ D₆= 21 giờ D₇= 24 giờ D₈= 27 giờ D₉= 30 giờ

- Tiến hành: Thí nghiệm này cũng được tiến hành tương tự với thí nghiệm 2.
Môi trường thạch dĩa
- Mục đích: Quan sát và so sánh sự phát triển của khuẩn lạc nấm men YEB theo thời gian trên 2 môi trường đạm pepton và đạm bột trùn quế thay thế.

- Tiến hành: Môi trường thạch đĩa có thành phần giống như trong môi trường lỏng nhưng thêm 2% agar. Dùng que cấy chuyển nấm men lên đĩa trong điều kiện vô trùng và ủ ở 30^oC. Quan sát và chụp hình khuẩn lạc của nấm men sau 24 và 36 giờ.

PHẦN IV: KẾT QUẢ THẢO LUẬN

1. Thành phần đạm nguyên liệu
Mẫu trùn quế chuẩn bị trong phần thực nghiệm II.1.a, sau 24 giờ tự thủy phân được đun sôi 30 phút, ly tâm 7000 vòng/phút, 20 phút. Thu được 180 ml dịch đạm thủy phân xác định hàm lượng protein hòa tan và đạm amin cùng với mẫu pepton (Hà Lan) làm đối chứng. Kết quả ghi nhận được theo bảng 4.

_{Bảng 4: Kết quả đo protein và đạm amin của dịch đạm thủy phân và pepton.}

Mẫu	Protein tổng (mg)	Đạm amin tổng (mgN)
Dịch đạm thuỷ phân	20,88	1299
Pepton Hà Lan	49,06	719

Trong dịch đạm thuỷ phân và pepton, thành phần chiếm đa số là các peptid ngắn và acid amin, do đó khi xác định protein bằng phương pháp Bradford cho kết quả rất thấp do thuốc thử này chỉ bắt màu với những protein có trọng lượng phân tử trên 4000 Da (Nielsen S.S, 2003). Ngoài ra, với cùng một khối lượng mẫu 26,52 gam thì hàm lượng đạm amin trong bột trùn quế đã được thủy phân cao hơn so với pepton Hà Lan, gấp khoảng 1,8 lần. Dự đoán đây có thể là môi trường rất thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật. Vì vậy, kết quả này bước đầu rất có ý nghĩa để tính lượng đạm amin bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở các thí nghiệm tiếp theo.

2. Sử dụng sản phẩm thủy phân của trùn quế để nuôi vi sinh vật
a. Kết quả xác định lượng đạm amin trùn quế thay thế pepton thích hợp cho môi trường nuôi cấy vi khuẩn E. coli DH 5

Tính toán lượng đạm amin dịch thủy phân trùn quế đưa vào chuẩn bị môi trường

nuôi cấy ở các nghiệm thức thay thế đạm pepton từ 0%, 25%, 50%, 75% và
100% (A1, A2, A3, A4 và A5), không thay đổi các thành phần khác. Sau 16 giờ nuôi cấy liên tục, tiến hành lấy mẫu đo độ đục ở độ hấp thụ OD_600n_m. Kết quả cho ở bảng 5 cho ta thấy các nghiệm thức thay thế đạm pepton từ 0%, 25%,

50%, 75% có độ đục không khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p>0,05).

Nghiệm thức thay thế đạm pepton bằng 100% đạm trùn quế có độ đục cao nhất,

khác biệt có ý nghĩa với các nghiệm thức còn lại. Điều này chứng tỏ với môi trường đạm trùn quế thủy phân 100% vi khuẩn E. coli DH 5 đã phát triển tốt nhất và tốt hơn cả môi trường chỉ có đạm pepton thương mại (nghiêm thức A1). Bảng 5: Kết quả đo độ đục các nghiệm thức thay thế pepton khác nhau nuôi cấy E. coli DH 5 .

Nghiệm thức	A1	A2	A3	A4	A5
OD* 600nm	0,518^b	0,517^b	0,530^ab	0,518^b	0,540^a

* Các giá trị trung bình có cùng chữ thì không khác biệt có ý nghĩa (p< 0,05)

Kết quả thí nghiệm cũng tương tự của Nakajima và ctv (2000) dùng dịch đạm tự thủy phân trùn đất Lumbricus rubellus nuôi cấy vi khuẩn E. Coli XL 1-Blue cho sự tăng trưởng vi khuẩn bình thường so với bột pepton đối chứng trên môi trường LB với tỉ lệ bột pepton là 1% (w/v) sau 30 giờ nuôi cấy. Như vậy có thể khẳng định dung dịch đạm trùn quế thủy phân 100% hoàn toàn có thể thay thế đạm pepton trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật phổ biến LB. Hình 2 sau đây mô tả sự phát triển của vi khuẩn E. coli DH 5 sau 16 giờ nuôi cấy.

A1 A2 A3 A4 A5 A1 A2 A3 A4 A5

_{Hình 2: Môi trường lỏng trước và sau khi nuôi vi khuẩn E. coli DH 5 16 giờ}

b. Kết quả theo dõi sự phát triển của vi khuẩn E. coli DH 5 theo thời gian
Trong môi trường lỏng

Sau thí nghiệm xác định lượng đạm amin trùn quế thay thế lượng pepton thích hợp cho nuôi cấy vi khuẩn E. coli DH 5 , nhận thấy dịch trùn quế thủy phân

hoàn toàn có thể thay thế bột đạm pepton, nên trong thí nghiệm theo dõi sự tăng trưởng nhóm vi khuẩn này theo thời gian được nuôi cấy trên hai môi trường

100% dịch thủy phân trùn quế và 100% lượng pepton theo môi trường LB. Kết quả hình 3 cho thấy đường tăng trưởng của vi khuẩn E. coli DH 5theo thời gian trên hai môi trường đều như nhau. Ở thời điểm ban đầu vi khuẩn có mật số bằng nhau, nhưng sau 3 giờ tăng trưởng vi khuẩn bắt đầu tăng sinh khối mạnh (giai đoạn log) và đạt đến cực đại ở móc thời gian 18 giờ. Sau đó thì chuyển sang giai đoạn cân bằng và chết.

Tuy nhiên, trong môi trường đạm trùn quế thủy phân, vi khuẩn phát triển mạnh hơn khoảng 1,5 lần so với môi trường đạm pepton. Ngay từ đầu giai đoạn log, E. coli DH 5 trong môi trường đạm trùn quế đã có xu hướng phát triển vượt trội và đạt giá trị OD_600n_mtối đa (0,650) ở 18 giờ. Trong khi đó, nếu sử dụng đạm pepton thì giá trị OD_600n_mchỉ đạt 0,436. Sau thời điểm này thì ở cả hai môi trường đạm khác nhau vi khuẩn đều chuyển sang giai đoạn cân bằng. Kết quả thống kê ở từng thời điểm từ 6 giờ đến 30 giờ giữa hai nghiệm thức đều có sự khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) (bảng 11, phụ lục 1).Từ kết quả trên, một lần nữa khẳng định khả năng thay thế đạm trùn quế trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn là rất khả thi, mở ra một hướng ứng dụng mới từ trùn quế. Đây là nguồn đạm dồi dào vừa rẻ tiền

_{lại vừa cho hiệu quả cao.}

0.7
0.6

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0

0 5 10 15 20 25 30

_{Thời gian tăng trưởng (giờ)}

Pepton

Trùn quế thủy phân

tải về 1.3 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:

1 2 3 4 5 6 7