1.ĐẶt vấN ĐỀ 3 TỔng quan về VI nấm nội sinh 4

tải về 147.14 Kb.

Chuyển đổi dữ liệu	02.09.2016
Kích	147.14 Kb.
	#31378

MỤC LỤC

1.ĐẶT VẤN ĐỀ 3

2. TỔNG QUAN VỀ VI NẤM NỘI SINH 4

2.1. Vi nấm nội sinh: 4

2.2.Quan hệ giữa vi nấm nội sinh và thực vật: 4

2.3. Nguyên tắc cơ bản để chọn thực vật ly trích vi nấm nội sinh [14,29]: 4

2.3.1. Thực vật sống trong môi trường sinh học bất thường: 4

2.3.2. Thực vật được sử dụng như dược liệu dân gian: 5

2.3.3. Thực vật có tính đặc thù về sinh thái: 5

2.4. Một số vi nấm nội sinh sản xuất các chất biến dưỡng thứ cấp có hoạt tính sinh học: 5

2.4.1. Vi nấm nội sinh sản xuất kháng sinh: 5

2.4.2. Vi nấm nội sinh sản xuất các chất có tác động sinh học khác 6

2.5. Ly trích vi nấm nội sinh: 6

2.6. Nuôi cấy và chiết tách chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm nội sinh: 6

3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 7

3.1. Các nghiên cứu ở nước ngoài 7

3.2. Các nghiên cứu trong nước 8

4. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU 10

5. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

5.1. Đối tượng nghiên cứu 10

5.2. Các phương pháp nghiên cứu 10

5.2.1. Ly trích vi nấm nội sinh từ thực vật 10

5.2.2. Khảo sát hoạt tính sinh học của các chủng vi nấm nội sinh 12

5.2.3. Định danh những chủng vi nấm có hoạt tính ở mức Chi [16] 12

5.2.4. Khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu để các chủng vi nấm nội sinh sản xuất tối đa hoạt chất sinh học 13

5.2.5. Chiết tách các chất biến dưỡng có tác động sinh học từ các chủng vi nấm nội sinh 13

5.2.6. Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh 13

6. NỘI DUNG VÀ PHẠM VI CỦA VẤN ĐỀ SẼ ĐI SÂU NGHIÊN CỨU 14

7. NƠI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 14

8. TÀI LIỆU THAM KHẢO 15

[12]. Deborah KB Runyoro, Mecky IN Matee, Olipa D Ngassapa, Cosam C Joseph, Zakaria H Mbwambo, (2006), Screening of Tanzanian medicinal plants for anti-Candida activity, BMC Complement Altern Med. 16

[13]. E. Christine Davis, Joseph B. Franklin, A. Jonathan Shaw and Rytas Vilgalys, (2003), Endophytic Xylaria (Xylariaceae) among liverworts and angiosperms: phylogenetics, distribution, and symbiosis, American Journal of Botany 90(11),1661-1667. 16

[25]. Rios J.L, Recio M.C., Villar A., (1988), Screening methods for natural products with antimicrobial activity: A review of the literature, Journal of Ethnopharmacology, Volume 23, pp 127–149. 16

[26]. Ranganathan S, Balajee SA., (2000), Anti-Cryptococcus activity of combination of extracts of Cassia alata and Ocimum sanctum, Mycoses.43(7-8), pp 299-301. 16

[27]. Sai-Cheong Lee, Chang-Phone Fung, Ning Lee, Lai-Chu See, Jen-Seng Huang, Chi-Jen Tsai, Kuo-Su Chen, Wen-Ben Shieh (2001), Fluconazole Disk Diffusion Test with Methylene Blue- and Glucose-Enriched Mueller-Hinton Agar for Determining Susceptibility of Candida Species, J Clin Microbiol., 39(4), pp 1615–1617. 16

TÓM TẮT LUẬN ÁN

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) có khoảng 80% dân số thế giới từ các nước phát triển dựa chủ yếu vào các loại thuốc truyền thống (chủ yếu có nguồn gốc từ thực vật) để chăm sóc sức khỏe. Trong 119 loại hợp chất hóa học, ít nhất 90 loại có nguồn gốc từ thực vật, đây là các loại thuốc đang được sử dụng ngày càng nhiều ở nhiều quốc gia (theo Balick và cộng sự, 1996). Hiện nay có rất nhiều chất chiết xuất từ cây có tác dụng chữa bệnh, vấn đề đặt ra là các chất có hoạt tính sinh học trong cây là do chính cây sinh ra hay là kết quả của mối liên hệ tương sinh với các vi sinh vật nội sinh có ích trong mô thực vật. Vi sinh vật nội sinh thực vật (endophyte) là những vi sinh vật phát triển bên trong các mô sâu của cây nhưng thường không gây bệnh cho cây chủ [14]. Trong đó, vi khuẩn và vi nấm là các vi sinh vật nội sinh thường gặp nhất. Tần số ly trích được vi sinh vật nội sinh là vi nấm chiếm tỷ lệ cao hơn, vì vậy cơ hội tìm ra chủng vi nấm nội sinh mới từ cây là rất cao. Những nghiên cứu gần đây của Hawksworth và Rossman đã ước tính có đến 1 triệu loài vi nấm khác nhau, nhưng chỉ khoảng 100.000 loài đã được mô tả [17,16]. Hiện tại và tương lai vi nấm nội sinh sẽ là nguồn đa dạng sinh học dồi dào, mới lạ trong đó có nhiều loài chưa được biết đến.

Vi nấm nội sinh có mối quan hệ chặt chẽ với cây chủ, chúng sử dụng các chất dinh dưỡng trong cây để tồn tại, mang lại nhiều lợi ích cho cây như tạo ra các sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học như các hormon sinh trưởng, các chất kháng sinh có khả năng bảo vệ cây khỏi các vi sinh vật gây bệnh. Nhiều tài liệu cho thấy khi sống cộng sinh trong mô thực vật, vi nấm nội sinh đã sản sinh ra nhiều chất có hoạt tính sinh học như kháng khuẩn và kháng nấm, ví dụ như Kennedia nigriscans, một loài cây leo ở Úc đã được dân gian sử dụng sáp nhựa để trị vết thương, sát trùng; từ cây này đã ly trích được chủng Streptomyces sp. NRRL 30562 mới sản xuất kháng sinh munumbicin phổ rộng [29]. Ở quy mô rộng, vi nấm nội sinh có tác động quan trọng trong nông nghiệp, rừng và đang được quan tâm nghiên cứu và tiềm năng của chúng có ý nghĩa rất lớn trong các lĩnh vực y học, nông nghiệp và công nghiệp..

Họ Rutaceae ở Việt Nam rất đa dạng, có khoảng 140 loài trong đó cam, chanh, quýt, bưởi...là những cây trồng phổ biến, có nhiều ứng dụng trong dược phẩm, thực phẩm…Thân, cành, lá, hoa và vỏ quả các loại cây này chứa nhiều tinh dầu…Nhiều công trình nghiên cứu trên thực vật cũng như trên người cho thấy tinh dầu của vỏ quả các cây họ Rutaceae có tác dụng an thần, chữa cảm cúm. Bên cạnh đó, các cây thuộc họ Zingiberaceae cũng có vai trò quan trọng trong đời sống con người. Từ xa xưa, gừng đã trở thành gia vị, thức ăn, vị thuốc hết sức quan trọng của người Á đông. Theo nghiên cứu của Nguyễn Nghĩa Thìn và cộng sự thì số lượng các loài có khả năng chữa bệnh ung thư là 50 loài thuộc 36 chi và 24 họ, trong số đó, họ Zingiberaceae là đa dạng nhất (16%). Trên thế giới cũng đã có nhiều nghiên cứu về các hoạt tính sinh học như tính kháng viêm, chống lão hóa, kháng khuẩn mạnh, ức chế khối u…cùng nhiều tác dụng khác của các cây họ Gừng, đặc biệt là các cây gừng, riềng, nghệ. Từ những đặc tính trên cho thấy, tiềm năng những họ này chứa hệ endophyte phong phú, tiết nhiều chất biến dưỡng và có ý nghĩa trong việc điều trị bệnh...Tuy vậy, cho đến nay, ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về endophyte trên các loài cây thuộc họ Rutaceae và Zingiberaceae. Do đó, việc nghiên cứu tìm kiếm các chủng vi nấm nội sinh có khả năng tạo ra các chất biến dưỡng có lợi và có khả năng sản sinh các chất có hoạt tính sinh học với hy vọng dùng để điều trị bệnh cho người là một công việc hết sức thú vị và được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học của vi nấm nội sinh được phân lập từ cây họ Rutaceae và Zingiberaceae” với mục tiêu chính là tìm được các chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính sinh học cao trên các họ thực vật này.

2. TỔNG QUAN VỀ VI NẤM NỘI SINH

2.1. Vi nấm nội sinh:

Endophyte là những vi sinh vật sống ở mô sâu thực vật nhưng không gián tiếp hoặc trực tiếp gây bất lợi cho cây [24]. Vi nấm nội sinh là thành phần chiếm tỉ lệ cao trong hàng ngũ đông đảo endophyte thực vật hiện nay. Vi nấm nội sinh có mối quan hệ chặt chẽ với cây chủ, chúng sử dụng các chất dinh dưỡng trong cây để tồn tại, mang lại nhiều lợi ích cho cây như tạo ra các sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học như các hormon sinh trưởng, các chất kháng sinh có khả năng bảo vệ cây khỏi các vi sinh vật gây bệnh.

2.2.Quan hệ giữa vi nấm nội sinh và thực vật:

Giữa vi nấm nội sinh và thực vật có mối quan hệ cộng sinh hoặc tương sinh, vi nấm nội sinh xuất phát từ một số bệnh lý thực vật trong quá trình tiến hóa của cây. Sự tương tác giữa cây chủ và vi sinh vật gây bệnh trong suốt quá trình phát triển lâu dài dẫn đến việc xuất hiện những đột biến gen từ những vi sinh vật gây bệnh để cho ra những chủng vi nấm nội sinh hữu ích. Chúng được xem như là một tác nhân giúp cân bằng hệ vi sinh trên cây chủ nhằm ngăn chặn những tác nhân vi sinh gây bệnh [16,28].

Vi nấm nội sinh thúc đẩy khả năng thích nghi sinh thái của thực vật chủ. Ở một số loài cây cỏ có vi nấm nội sinh sống, người ta nhận thấy chúng có khả năng gia tăng sức chịu đựng khô hạn hoặc chịu được độc tính của nhôm trong nguồn nước, trong môi trường sống… Ngoài việc bảo vệ cây chống lại một số yếu tố bất lợi cho kí chủ như động vật ăn cỏ hoặc côn trùng, nhiều sản phẩm tự nhiên được sinh ra từ vi nấm nội sinh cũng đã được quan sát, theo dõi và được kết luận về khả năng ngăn chặn, kìm hãm hay diệt nhiều mầm bệnh khác nhau xâm nhập mô thực vật. Trước thực tế này, một câu hỏi được đặt ra rằng: các hoạt chất quí giá này do chính cây sản xuất hay là kết quả của mối quan hệ tương sinh của các vi nấm nội sinh có ích trong mô thực vật và cây chủ sinh ra. Theo nhiều tài liệu nghiên cứu cho thấy một số chất biến dưỡng của vi nấm nội sinh không những tác động trên những mầm bệnh thực vật mà còn có khả năng trị liệu trên vi khuẩn, nấm, virus và những sinh vật đơn bào gây bệnh cho người và động vật.

2.3. Nguyên tắc cơ bản để chọn thực vật ly trích vi nấm nội sinh ^[14,29]:

Trên thế giới có hàng triệu loài thực vật. Đó là một số lượng quá lớn mà ta không thể thử nghiệm hết cũng như không thể chọn lựa một cách ngẫu hứng khi đưa vào nghiên cứu. Do đó, việc chọn thực vật để ly trích vi nấm nội sinh cũng cần phải dựa trên những đối tượng cây có đặc điểm sinh học. Một số nguyên tắc cơ bản sau đây thường được áp dụng:

2.3.1. Thực vật sống trong môi trường sinh học bất thường:

Với những loài thực vật này, môi trường bất thường và các điều kiện tự nhiên khắc nghiệt bắt buộc cây muốn tồn tại thì cần có yếu tố đặc biệt nào đó giúp cây có khả năng chống chịu cao. Và người ta mong đợi nhân tố đó chính là các vi nấm nội sinh có ích.

Ví dụ: Rhyncholacis penicillata là một loài cây sống dưới nước ở Tây Nam Venezuela, nơi mà môi trường nước rất khắc nghiệt, cây luôn bị va đập bởi tác dụng nước cuốn, mảnh vụn, đá sỏi…làm cho cây bị tổn thương. Từ đó các nấm gây bệnh thực vật có thể xâm nhập, nhưng cây vẫn khỏe mạnh, vì cây được sự bảo vệ bởi các vi nấm nội sinh có trong cây. Dựa vào đặc điểm sinh học này, chủng Serratia marcescens được ly trích từ cây R. penicillata có khả năng sản xuất ra oocydin A, một hợp chất kháng nấm mới.

2.3.2. Thực vật được sử dụng như dược liệu dân gian:

Một số loài thực vật đã được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, từ đời này sang đời khác để chữa lành vết thương, kháng nấm, kháng khuẩn…ví dụ như, Kennedia nigriscans, một loài cây leo ở Úc đã được dân gian sử dụng sáp nhựa để trị vết thương, sát trùng. Từ cây này đã ly trích được chủng Streptomyces sp. NRRL 30562 sản xuất kháng sinh phổ rộng munumbicin, kháng được nấm gây bệnh thực vật, vi khuẩn và Plasmodium.

2.3.3. Thực vật có tính đặc thù về sinh thái:

Các thực vật có tuổi thọ cao bất thường, phát triển trong các vùng có biến đổi sinh học lớn, hay sống trong khu vực đất đai cổ xưa…cũng là những đối tượng nghiên cứu rất lý tưởng để cung cấp các vi nấm nội sinh mới lạ.

2.4. Một số vi nấm nội sinh sản xuất các chất biến dưỡng thứ cấp có hoạt tính sinh học:

Nhiều vi nấm sống nội sinh trong cây đã được ly trích, chúng có khả năng sản sinh những chất biến dưỡng có hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng nấm, kiềm hãm khối u, chống oxy hóa và các hoạt tính sinh học khác.

2.4.1. Vi nấm nội sinh sản xuất kháng sinh:

Fusarium sp. là vi nấm ly trích từ cây Selaginella pallescens, được thu nhập từ vùng Bảo vệ thực vật của Guanacaste của Costa Rica, sản xuất được một pentaketide mới là CR 337 cho tác dụng mạnh trên C.albicans.

Pestralotiopisis microspora thường gặp ở rừng mưa, sản xuất nhiều chất có tác dụng sinh học, một trong những chất này là acid ambuic có tác dụng kháng nấm. Chất này được ly trích từ nhiều chủng P.microspora và được cho là chất tượng trưng được sản xuất bởi endophyte thực vật ở nhiều rừng mưa trên thế giới.

Ngoài ra, nhiều chủng nấm trong chi Pestalotiopsis đã được ly trích từ các nguồn thực vật khác, các chủng nấm này có thể sản xuất các kháng sinh kháng nấm.

Bảng 1. Petralotiopisis spp. và các chất biến dưỡng sinh học

Chủng nấm	Nguồn ly trích	Kháng sinh	Tác động sinh học
P.microspora	Torreya axifolia	Pestalopyrone Hydroxy-pestalopyrone	Kháng sinh thực vật
P.jesteri	Các cây mọc ở sông thuộc Papua New Guinea	Hydroxyl-jesterone jesterone	Kháng nấm gây bệnh thực vật

Colletotrichum gloeosporioides là loại vi nấm nội sinh trong cây Artemisia mongolica sản xuất acid colletotric có tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm Helminthosporium sativum.
Colletotrichum sp. được ly trích từ Artemissia annua sản xuất những chất biến dưỡng kháng khuẩn, kháng vi nấm gây bệnh cho người và vi nấm gây bệnh cho thực vật.

Muscodor albus là vi nấm được ly trích từ cành của cây Quế (Cinnamomum zeylanicum), vi nấm này sản xuất một số chất bay hơi có thể ức chế vi khuẩn và nấm. Thành phần chính của những hợp chất này đã được xác định cấu trúc hóa học bằng GC-MS (sắc ký khí ghép với khối phổ), từ đó được tổng hợp hóa học. Các chất tổng hợp được có hiệu quả kháng khuẩn, kháng nấm, không độc với người.

Nodulisporium sp. được ly trích từ cây Bontia daphnoides sản xuất hợp chất nodulisporic có hiệu lực trừ sâu, chống lại ấu trùng của ruồi xanh, nhặng…
Muscodor vitigenus được ly trích từ cây dây leo Paullina paullinioides sản sinh ra napthalen có tác động trừ rệp.

2.4.2. Vi nấm nội sinh sản xuất các chất có tác động sinh học khác

Từ môi trường nuôi cấy vi nấm nội sinh, một số chất có tác động chống oxy hóa, làm hạ đường huyết, gây ức chế miễn dịch đã được ly trích.

Bảng 2. Các vi nấm nội sinh sản xuất các chất có tác động sinh học khác

STT	Vi nấm	Nguồn ly trích	Tên chất	Tác động sinh học
1	Pestalotiopsis microspora	Termialia morobensis	Pestacin Isopestacin	Kháng khuẩn và chống oxy hóa
2	Pseudomasssaria sp.	Thực vật ở rừng mưa Châu Phi	Nonpeptidal (L-783,281)	Giảm glucose huyết với cơ chế tương tự insulin nhưng sử dụng qua đường uống
3	Fusarium subglutinans	T-wifordii	Subglutinol A Subglutinol B	Giảm lympho bào B và T (ức chế miễn dịch)

2.5. Ly trích vi nấm nội sinh:

Vi nấm nội sinh có mặt ở khắp nơi trong thế giới thực vật, số lượng của chúng tìm thấy thay đổi tùy thuộc vào bộ phận cây, chủng loại cây và môi trường sống của nó. Đã có nhiều kĩ thuật ly trích vi nấm nội sinh được đề nghị bởi nhiều tác giả khác nhau. Nhưng tất cả các quy trình ly trích đều dựa trên cơ sở chung nhất đó là: giải quyết tốt giai đoạn xử lý bề mặt, diệt các sinh vật ngoại nhiễm bằng chất sát trùng hoặc các phương pháp sát trùng. Sau đó tạo điều kiện không nhiễm để chỉ thu nhận các endophyte phát triển từ nội mô thực vật. Tiếp theo chọn nuôi cấy trên môi trường thích hợp và thử hoạt tính sinh học [14,28,29].

2.6. Nuôi cấy và chiết tách chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm nội sinh:

Rất nhiều chất có hoạt tính sinh học được tạo ra bởi các vi nấm nội sinh trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Tìm kiếm và khám phá những hoạt chất đó chính là đích ngắm mà các nhà nghiên cứu sinh dược học không ngừng vươn tới. Rất nhiều phương pháp đã được ứng dụng để phục vụ công việc này. Sau khi chọn lọc được chủng vi nấm nội sinh và môi trường thích hợp để sản sinh hoạt chất mong muốn, thông thường chủng này được đưa vào môi trường nuôi cấy lỏng với những thông số điều kiện nuôi cấy phù hợp. Bước tiếp theo là dùng các dung môi chiết tách hoạt chất. Sản phẩm thu được sẽ được thử hoạt tính sinh học và tinh khiết hóa bằng các kĩ thuật sắc kí.

Sơ đồ 1. Tiến trình chiết tách và tinh khiết hóa ergosterol peroxid phân lập từ chủng nấm Trichomonas konilangbra nội sinh trên cây khổ sâm (Croton tonkinensis Gagnep.) ^[1].

3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

3.1. Các nghiên cứu ở nước ngoài

Năm 1955, trên thế giới chỉ tìm ra được 500 chất kháng sinh thì 20 năm sau, năm 1975 đã tìm ra được 5.000 chất kháng sinh. Theo Berdy, năm 1984 trên thế giới đã biết được hơn 13.000 chất kháng sinh được sản xuất từ thiên nhiên. Theo đó, từ những năm 1990, Taxomyces andreanae lần đầu tiên được ly trích từ cây Taxus brevifolia, vi nấm này sản xuất paclitaxel - chất ức chế các thoi phân bào trong quá trình phân chia tế bào, có phổ khối tương tự như paclitaxel chiết xuất từ cây thông đỏ (Taxus). Một số nhà khoa học đã nghiên cứu khu hệ nấm nội sinh của các cây thuộc chi Thông đỏ và tìm thấy các hoạt chất taxol (một hoạt chất được sử dụng hiệu quả nhất trong điều trị bệnh ung thư buồng trứng, ung thư vú) do nấm nội sinh tổng hợp. Chi thông đỏ (Taxus) luôn là 1 nguồn giàu nấm nội sinh.

Năm 1995 – 1996, các nhà nghiên cứu đã phân lập được hàng trăm loài nấm nội sinh từ các cây thông đỏ ở Châu Âu, Châu Á và Bắc Mỹ. Có thể nói các cây thông đỏ là một kho báu chứa nhiều vi sinh vật chưa từng được phát hiện và rất đáng chú ý, chúng tương tác với nhau và với cây chủ. Những nấm đã được biết là có tổng hợp taxol gồm: Taxomyces andreanae, Pestolotiopsis microspora. Ngoài ra, thông qua những bằng chứng miễn dịch học, người ta cũng đã phát hiện được sự tổng hợp taxol ở nhiều nấm nội sinh khác phân lập từ cây thông đỏ Taxus brevifolia, bao gồm nhiều chủng của Penicillium sp., Pestalotiopsis sp. và Truncatella sp.

Bảng 3. Một số vi nấm nội sinh sản xuất paclitaxel

STT	Vi nấm nội sinh	Nguồn ly trích
1	Pestalotiopsis microspora	Taxus wallichiana
2	Pestalotiopsis guepini	Wollemia nobilis (cây quý hiếm)
3	Seimatoantlerium	Maguireothamnus sprciosus

Năm 2000, Strobel và cộng sự đã nghiên cứu về vai trò của vi nấm nội sinh Streptomyces sp. chủng NRRL 30562 được ly trích từ cây Kennedia nigriscans, sản xuất kháng sinh phổ rộng munumbicin, kháng vi khuẩn Gram (+) như Bacillus anthracis, M.tuberculosis đa kháng và một số vi khuẩn kháng thuốc khác. Streptomyces sp. chủng NRRL 30562 phát triển trong lá cây Grevilea pteridifolia phát triển ở Úc, sản xuất kháng sinh kakadumicin và echinomycin đều cho tác động kháng P.falciparum với LD50=7-10ng/ml [29].

Năm 2001, Tan và Zou chứng minh rằng vi nấm nội sinh cũng được công nhận là nguồn phong phú của chất chuyển hóa cho hoạt tính sinh học.

Năm 2003, Strobel và cộng sự đã nghiên cứu về chủng vi nấm nội sinh Cryptospriopsis quercina được ly trích từ cây Tripterigeum wilfordii, vi nấm này có thể sản xuất cryptocandin và cryptocin. Trong đó, cryptocandin kháng một số vi nấm gây bệnh cho người như Candida albicans, Trichophyton spp. và chống một số nấm gây bệnh thực vật như Sclerotinia sclerotiorum và Botrytis cinerea. Cryptocin có tác dụng kháng Pryriaria oryzae và một số vi nấm gây bệnh thực vật [16]. Cùng năm 2003, T. Taechowisan và S.lumyong đã nghiên cứu về endophyte có hoạt tính kháng nấm từ rễ cây Zingiber officinale và Alpinia galanga.

Năm 2006, N.S.H.Raviraja và cộng sự nghiên cứu về khả năng kháng nấm của các vi nấm nội sinh từ các cây dược liệu miền Tây Ấn Độ…

Năm 2007, Li và cộng sự đã tìm ra vi nấm Acremonium (2F09P03B) từ Huperzia serrate có khả năng sản xuất huperzine A có tác dụng là chất ức chế enzyme acetylcholinesterase, và được dùng trong điều trị bệnh Alzheimer.

Năm 2009, Kusari và cộng sự đã phân lập được Fusarium solani từ Camptotheca acuminate có khả năng sản xuất camptothecin và 2 dẫn xuất (9-methoxycamptothecin và 10-hydroxycamptothecin) có khả năng chống ung thư.

Năm 2012, Agnes Joseph Aswathy và cộng sự đã nghiên cứu về endophyte trong cây Nghệ (Curcuma longa). Các chất dinh dưỡng trong thân rễ của cây nghệ là môi trường sống đa dạng cho các nhóm vi khuẩn khác nhau. Một số vi khuẩn nội sinh liên quan có thể thúc đẩy tăng trưởng. Trong nghiên cứu này, hai chủng endophyte Paenibacillus sp. được phân lập từ thân rễ củ nghệ và cả hai chủng đã được tìm thấy có khả năng để sản xuất IAA qua phân tích HPLC [7].

Năm 2012, Cui và cộng sự đã phát hiện vi nấm nội sinh Fusarium oxysporum phân lập từ cây Ginkgo biloba có khả năng sản xuất ginkgolid B dùng để điều trị bệnh tim mạch.

3.2. Các nghiên cứu trong nước

Từ năm 1994, các nhà nghiên cứu trong nước đã phân lập được 6 chủng nấm nội sinh từ vỏ cây thông đỏ; đã định được tên của 6 chủng nấm này. Đây là loài thực vật đặc hữu có ở Việt Nam, từ lâu đã được nhân dân ta sử dụng như một vị thuốc. Chúng thường được phân bố ở Pà Cò, Mai Châu, Hòa Bình, Nghệ An, Hà Tĩnh, Phú Yên, Khánh Hòa, và chủ yếu là ở Lâm Đồng. Trong đó đáng chú ý là chủng nấm Pestalotiopsis maculans (corda) NagRai. có mặt ở tất cả các mẫu vỏ của cây thông đỏ được lấy mẫu. Chúng phù hợp nhất với hình thái chủng nấm Pestalotiopsis sp. được tìm thấy trong vỏ cây thông đỏ ở Mỹ và được các nhà khoa học tiến hành lên men, nuôi cấy, chiết rút, chạy sắc kí bản mỏng cùng với chất taxol chuẩn [30].

Năm 2005, Lê Mai Hương và cộng sự đã phân lập, sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của 45 mẫu cây lấy ở vùng Yên Tử, Hà Nội và vườn thuốc Mê Linh thu được 89 chủng vi nấm nội sinh trong đó có 32 chủng có hoạt tính kháng sinh (chiếm 36%); 20 chủng có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn (chiếm 22,5% tổng số), 26 chủng có hoạt tính kháng khuẩn (chiếm 29,2 % tổng số), 27 chủng có hoạt tính kháng nấm (chiếm 30,33% tổng số chủng phân lập). Từ 32 chủng có hoạt tính, bằng phương pháp lên men tách chiết sơ bộ đã chọn được 9 chủng có hoạt tính mạnh, hoạt phổ rộng, đặc biệt chủng có kí hiệu N2 phân lập từ cây họ Chôm có hoạt tính cao nhất, kháng Bacillus subtilis (ATCC25922) và Fusarium oxyporum [2].

Năm 2009, Trần Thị Như Hằng và cộng sự nghiên cứu về vi nấm nội sinh trên cây khổ sâm (Croton tonkinensis Gapnep.) và bùm bụp (Mallotus paella Lour.) thu được chủng nấm Trichoderma konilangbra KS14 sản sinh chất ergosterol, ergosterol peroxide, sorbicillin cho hoạt tính kháng vi sinh vật, độc tế bào, chống oxy hóa và hoạt tính enzym ngoại bào; sorbicillin cho hoạt tính kháng S.aureus với MIC=25mg/ml. Chất ergosterol peroxid biểu hiện hoạt tính độc tế bào mạnh với cả 3 dòng tế bào thử là ung thư gan, ung thư màng tử cung và ung thư màng tim [1].

Năm 2010, Nguyễn Đinh Nga và cộng sự sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh thực vật trên cây ngũ sắc (Lanata camara L.) thu được chủng Pseudeurotium NS-T1 kháng C.albicans, trên cây mã đề (Plantago major L.) thu được chủng Fusarium MĐ-TR1 và MĐ-TR3 cho hoạt tính kháng C.albicans và MRSA; tía tô (Perilla ocymoides L.) thu được chủng Trichoderma TT-L1 kháng C.albicans và MRSA; trầu (Piper betle L.) thu được chủng Fusarium TR-T1 kháng C.albicans…[3]

Năm 2010, các nhà nghiên cứu thuộc phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên đã đưa ra biểu đồ về quy luật phân bố của các chủng nấm nội sinh trên các bộ phận của cây thông đỏ (Taxus wallichiana). Theo đó, vi nấm nội sinh được phân bố trên tất cả các bộ phận khác nhau, nhiều nhất ở lá (50 chủng), thân (43 chủng), cành (39 chủng), rễ (24 chủng) và ít nhất là ở quả (1 chủng). Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết 68 chủng nấm nội sinh, kết quả có 17 mẫu (25%) có hoạt tính gây độc với cả 3 dòng tế bào ung thư như mẫu chiết của các chủng SHT4, SHT6, SHT9…Bằng phương pháp phân loại hình thái và sinh học phân tử đã định tên được 4 chủng nấm là Trichoderma aureoviride SHT06; Daldinia fissa SHT46; Eupenicillium ehrlichii SHT101và Gongroniella butleri SHT106. Hợp chất SHT46.1 thể hiện hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư cơ vân với giá trị IC50 là 4,19 μg/ml. Hợp chất SHT 101.1 biểu hiện khả năng kháng mạnh vi khuẩn S. aureus với MIC là 25 μg/ml. Hợp chất SHT 101.2 có hoạt tính gây độc 2 dòng tế bào ung thư phổi và ung thư cơ vân với giá trị IC50 tương ứng là 4,0 và 3,06 μg/ml. Kết quả thực nghiệm cho thấy các chủng nấm lựa chọn đều có khả năng ức chế sâu bệnh với tỉ lệ tương đối cao, từ 11,4-31,4% so với đối chứng. Với các kết quả đạt được, dự án đã góp phần tích cực vào công tác bảo tồn và phục hồi hữu hiệu các loài thông quý hiếm đang bị đe dọa tuyệt chủng ở Việt Nam, đồng thời giúp các nhà quản lý hiểu biết tốt hơn về vai trò của vi nấm nội sinh và sản phẩm của chúng trong việc hỗ trợ điều trị bệnh ung thư [30].

Năm 2014, Đàm Sao Mai và cộng sự đã phát hiện ra môi trường nuôi cấy thích hợp cho vi nấm nội cộng sinh Fusarium oxyporum được phân lập trên Thông đỏ (Taxus wallichiana) tại vùng Lạc Dương, Lâm Đồng và lượng taxol sinh ra ở môi trường nuôi cấy là 250,98 mg/kg khối lượng khô.

4. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

Phân lập và sàng lọc được các chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính sinh học trên một số cây thuộc họ Rutaceace và Zingiberaceae.
Định danh chủng mạnh và khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu bằng phần mềm BC pharsofl.
Chiết tách các hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh.
Nghiên cứu về cấu trúc hóa học và tác dụng hoạt tính các hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh.

5. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

5.1. Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi nấm nội sinh được phân lập từ một số cây thuộc họ thực vật Rutaceae và Zingiberaceae.

5.2. Các phương pháp nghiên cứu

5.2.1. Ly trích vi nấm nội sinh từ thực vật

5.2.1.1. Lấy mẫu dược liệu ^[29]:

Đối tượng thu mẫu: Thực vật nghiên cứu có một trong các đặc điểm sau hoặc kết hợp nhiều đặc điểm:

Những cây đã được tài liệu nghiên cứu có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm.
Những cây thuốc theo kinh nghiệm dân gian sử dụng để rửa, chữa trị vết thương lỡ loét hoặc bệnh nấm ngoài da.

Xác định tên khoa học của thực vật: dựa theo những tên gọi dân gian, những mô tả về hình thái của thực vật, các đặc điểm hoa, quả, hạt (nếu có) và các bộ phận khác, để từ đó có cơ sở đem so sánh với khóa phân loại hoặc các tài liệu tham khảo chuyên biệt để xác định tên khoa học thực vật.
Nguyên tắc chọn mẫu:

Chọn những cây khỏe mạnh, không còi cọc, không bị sâu hại hay các biểu hiện bệnh như đốm lá, úng lá…
Thu tất cả các bộ phận của cây như rễ, thân, cành, lá, hoa của các cây trong họ thực vật nghiên cứu.

Mẫu sau khi thu hái được rửa sạch dưới vòi nước, để ráo nơi khô mát sau đó được xử lý ngay hoặc phải được giữ ở nhiệt độ thấp (khoảng 4 ^oC) trong vòng 24 giờ nếu kịp xử lý.

5.2.1.2. Phương pháp xử lý mẫu ^[14,24,29]:

Mẫu được xử lý tại PTN, trong điều kiện vô trùng của tủ cấy lần lượt các bước theo sơ đồ 2.

Sơ đồ 2. Quy trình xử lý mẫu

Chú ý: Kích thước và vị trí cắt để đưa mẫu vào ly trích vi nấm nội sinh:

Rễ: cắt thành từng đoạn dài 1cm.
Lá: cắt thành những mảnh vuông diện tích 1x1 cm, ở các vị trí dọc gân lá, 2 bên thịt lá ở các vị trí đầu, giữa, cuối và cuống lá.
Thân hoặc cành: cắt bỏ vỏ ngoài bằng dao vô trùng, chẻ nhỏ dọc theo thân, cắt thành từng đoạn dài 1 cm.

5.2.1.3. Ly trích vi nấm nội sinh:

Giai đoạn 1:

Mẫu cây sau khi được xử lý sẽ được đặt trên môi trường thạch, không chứa các chất dinh dưỡng khác. Các vi nấm nội sinh sẽ phát triển bằng chính các chất dinh dưỡng lấy từ mẫu cây.

Đĩa thạch đã đặt mẫu cây được ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự phát triển của vi nấm nội sinh trong khoảng từ 1-2 tuần.

Vi nấm nội sinh được phân biệt với các vi nấm ngoại nhiễm dựa vào nơi xuất phát của khóm nấm và khóm vi khuẩn.

Sau đó cấy chuyền vi nấm nội sinh sang môi trường dinh dưỡng thích hợp mới. Từ đó phân biệt các chủng giống khác nhau, ký hiệu chủng.

Giai đoạn 2:

Cấy chuyền vi nấm nội sinh sang môi trường dinh dưỡng thích hợp. Dựa vào đặc điểm về hình thái hoặc mô tả vi học để gộp chung những chủng giống nhau, phân biệt các chủng khác nhau và ký hiệu chủng.

Các môi trường thường sử dụng như thạch khoai tây đường (PDA), thạch Czapeck-Dox (CDA), thạch Sabouraud (SDA). Ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự phát triển của vi nấm nội sinh từ 1-2 tuần hoặc lâu hơn tùy theo tốc độ phát triển của vi nấm nội sinh [14,24].

5.2.2. Khảo sát hoạt tính sinh học của các chủng vi nấm nội sinh

Vi nấm nội sinh sẽ phóng thích chất biến dưỡng có hoạt tính sinh học vào môi trường nuôi cấy trong quá trình phát triển. Các tác động này được phát hiện và đánh giá bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch.

Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch:

Cấy chủng vi nấm nội sinh trên môi trường thích hợp, ủ ở t^o phòng từ 5 – 14 ngày cho vi nấm phát triển.
Cắt khóm nấm thành khoang thạch tròn đường kính 8 mm (gọi là khoanh thạch thử).
Đặt các khoanh thạch thử lên mặt thạch đã được trải vi nấm C.albicans (SDA) và vi khuẩn MRSA, E.coli, Staphylococcus sp., Streptomyces sp. (TSA), mỗi mẫu đặt ít nhất 3 khoanh. Làm 1 mẫu chứng.
Ủ ở 37^oC trong 24h đối với vi khuẩn và 48h đối với vi nấm.
Đọc kết quả: nếu vi nấm cho chất biến dưỡng có tác động kháng khuẩn, kháng nấm thì hoạt chất sẽ khuếch tán từ khoanh thạch thử ra môi trường cho vòng vô khuẩn xung quanh khoanh thạch thử (KTT).

Bảng 4. Mức độ kháng khuẩn, kháng nấm dựa theo đk vòng kháng sinh của KTT

Mức độ hoạt lực	Đường kính vòng kháng sinh (mm)
Mức độ hoạt lực	Kháng hoàn toàn	Kháng không hoàn toàn
+++	≥ 20	≥ 30
++	13 – 19	20 – 29
+	2 – 12	10 – 19
+/-	≤ 1	< 10
-	0	0

5.2.3. Định danh những chủng vi nấm có hoạt tính ở mức Chi ^[16]

Tên khoa học của các chủng vi nấm nội sinh cho chất biến dưỡng ra môi trường có tác động kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxi hóa… sẽ được xác định đến mức chi dựa trên các đặc điểm của vi nấm.

Các qui tắc chính trong định danh

Chủng nấm tuyệt đối thuần khiết (không lẫn nấm mốc và VSV khác).
Sử dụng môi trường nuôi cấy có thành phần phù hợp.
Quan sát và ghi lại các đặc điểm phân loại của chủng vi nấm cần định danh (đặc điểm khuẩn lạc, mặt phải, mặt trái, tốc độ phát triển, đặc điểm vi học…).
Dùng chuyên luận các nhóm phân loại để định loại nấm đến mức chi.
Kiểm tra chủng vi nấm đã định danh với chủng nấm có trong bộ sưu tầm mẫu.
Viết tên các nhóm phân loại đúng với danh pháp quốc tế.

Định danh

Định danh sơ bộ dưới kính hiển vi sau khi nhuộm với Lacto phenol cotton blue để sơ bộ phân loại nấm.
Cấy nấm vào các môi trường chuyên biệt.
Dựa vào hình thái khuẩn lạc (đường kính, màu sắc, hình dạng…) và các sắc tố vi nấm tiết ra môi trường để định danh.
Các vi nấm nội sinh sẽ được định danh theo khóa phân loại của Guy St. Germain, năm 1995.

5.2.4. Khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu để các chủng vi nấm nội sinh sản xuất tối đa hoạt chất sinh học

Môi trường nuôi cấy (nguồn nitơ và carbon, nguồn dầu trong môi trường nuôi cấy).
Nhiệt độ
pH môi trường
Độ thoáng khí
Thời gian nuôi cấy

5.2.5. Chiết tách các chất biến dưỡng có tác động sinh học từ các chủng vi nấm nội sinh

Chiết tách: Thăm dò dung môi chiết tối ưu: n-hexan, dichloromethan (CH₂Cl₂), ethyl acetat (EtOAc), chloroform.

Phương pháp khuếch tán qua đĩa giấy ^[20,27]: nhằm định tính nhanh hoạt lực các chất thu được trong giai đoạn chiết tách.

Dịch chiết để bay hơi dung môi đến cắn, hòa cắn trong methanol hoặc các dung môi hữu cơ. Lấy 10µl dịch thu được tẩm vào đĩa giấy kháng sinh.
Trải các vi nấm thử nghiệm lên mặt thạch với nồng độ thích hợp.
Đặt đĩa giấy kháng sinh đã được tẩm lên mặt thạch.
Ủ ở 37 ^oC trong 24 giờ đối với vi khuẩn và 48 giờ đối với vi nấm.

5.2.6. Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh

Nghiên cứu về hoá học

Sắc ký cột

Nạp dung môi khai triển và tiến hành thu phân đoạn, theo dõi khả năng phân tách (quan sát màu, chấm trên bản silicagel F₂₅₄ soi UV). Gộp từng phân đoạn theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng.

Sắc ký lớp mỏng

Thăm dò hệ dung môi khai triển. Phát hiện vết bằng UV 254 và 365 nm, kiểm tra tác động kháng khuẩn của các vết trên sắc ký đồ bằng kỹ thuật hiện hình sinh học.

Kỹ thuật hiện hình sinh học

Dịch chiết cô cắn được chấm trên bản mỏng và khai triển trong hệ dung môi thích hợp. Phát hiện sự phân tách các hợp chất bằng cách soi UV ở các bước sóng 254 nm, 365 nm, hoặc bằng các thuốc thử vanillin sulfuric… xác định số vết và Rf.

Trải các vi nấm thử nghiệm lên mặt thạch với nồng độ thích hợp.

Bản mỏng đã khai triển, đuổi hết dung môi và cắt thành những mảnh nhỏ tương ứng với từng vết trên sắc ký đồ, đặt trên đĩa petri đã trải vi nấm thử nghiệm.

Để 12 giờ ở nhiệt độ thấp (<10 ^oC) để hợp chất khuếch tán ra đĩa thạch. Sau đó lấy các mảnh bản mỏng ra rồi đem ủ ở 37 ^oC trong 24 giờ đối với vi khuẩn và 48 giờ đối với Candida albicans.

Xác định các đặc tính lý hóa của các chất tách được

Các chất thu được qua sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng chế hóa được đem xác định các chỉ tiêu: Phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại khả kiến (UV-vis), khối phổ (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).

Phương pháp phổ hồng ngoại (IR): Phương pháp phổ dao động là một trong những phương pháp hữu hiệu nhất để xác định các chất về định tính cũng như định lượng.

Sau khi ghi phổ hồng ngại, nếu chất nghiên cứu là hợp chất hữu cơ thì trước tiên nghiên cứu vùng dao động co giãn của H để xác định xem mẫu thuộc loại hợp chất vòng thơm hay mạch thẳng hoặc cả hai. Sau đó nghiên cứu các vùng tần số nhóm để xác định có hay không có các nhóm chức. Phương pháp xác định độ tinh khiết và phân tích định lượng.

Phương pháp phân tích sắc kí khí-khối phổ (GC-MS): Bản chất GC-MS là sự kết hợp của sắc ký khí (Gas Chromatography) và khối phổ (Mass Spectometry). Ngưỡng phát hiện của phương pháp này là 1 picogram. Xác định thành phần hóa học và định danh các cấu tử trong các hợp chất. Sắc ký khí (GC): phân tách hỗn hợp hóa chất thành một mạch theo từng chất tinh khiết. Khối phổ (MS): xác định định tính và định lượng.

Nghiên cứu về hoạt tính sinh học

Các chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm mạnh được thử nghiệm hoạt tính kháng sinh, chống oxi hoá.

Phương pháp đánh bắt gốc tự do: Các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxi hoá theo cơ chế dập tắt gốc tự do sẽ làm giảm màu của 1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl (DPPH). Xác định khả năng này bằng cách đo quang ở bước sóng có hấp thu cực đại.

Hoạt tính chống oxi hoá được tính theo công thức:

HTCO% = [(OD_C – OD_T)/OD_C x 100

OD_C: Mật độ quang của chứng dung môi

OD_T: Mật độ quang của mẫu thử

Thử hoạt tính kháng sinh của sản phẩm

Phương pháp pha loãng: Chất thử được hòa tan trong DMSO để đạt nồng độ gấp 100 lần nồng độ thử nghiệm cao nhất. Pha loãng trong môi trường lỏng sao cho nồng độ của DMSO nhỏ hơn 1% (đây là nồng độ không ức chế sự phát triển của vi nấm). Sau đó, ủ ở 37 ^oC trong 48 giờ đối với C. albicans, ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày đối với nấm da. Đọc kết quả bằng mắt thường. MIC là nồng độ thấp nhất của chất thử ức chế sự phát triển của vi khuẩn.

6. NỘI DUNG VÀ PHẠM VI CỦA VẤN ĐỀ SẼ ĐI SÂU NGHIÊN CỨU

Phân lập và sàng lọc các vi nấm nội sinh từ một số chi thực vật họ Rutaceace và Zingiberaceace.
Định danh đến mức chi các chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính sinh học
Nghiên cứu chuyên biệt từ một đến hai chủng vi nấm nội sinh sản sinh các hợp chất kháng khuẩn, kháng nấm mạnh hoặc phổ kháng khuẩn rộng và tiến hành định danh ở mức loài.
Thu nhận sinh khối các chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính cao đã phân lập được, chiết các hoạt chất và đánh giá sơ bộ khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của các chất chiết được.
Từ kết quả sàng lọc hoạt tính sinh học của các chủng vi nấm nội sinh; tiến hành chiết tách, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh.
Thử nghiệm hoạt tính sinh học các chất kháng khuẩn, kháng nấm thu được.

7. NƠI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

Luận văn được thực hiện tại:

Bộ môn Vi Sinh – Kí sinh, Khoa Dược, Trường Đại Học Y- Dược Tp. HCM.
Khoa Dược, Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành.

8. TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

[1]. Trần Thị Như Hằng và cộng sự (2009), Xác định cấu trúc và thử hoạt tính sinh học của ergosterol perxod phân lập từ chủng nấm Trichoderma konilangbra nội sinh trên cây Khổ sâm (Croton tonkinensis Gapnep), Tạp chí dược học (400), trang 60-65.

[2]. Lê Mai Hương và cộng sự (2005), Phân lập và sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn các chủng nấm nội sinh thực vật phân lập từ một số vườn thuốc phía Bắc Việt Nam, Tạp chí dược học (352), trang 20-23.

[3]. Nguyễn Đinh Nga và cs (2010), Sàng lọc vi nấm nội sinh thực vật kháng Candida albicans, Tạp chí Y – Dược học quân sự. 4, 17-24.

[4]. Nguyễn Hoàng Nghĩa, Phạm Quang Thu, (2006), Vai trò của vi khuẩn nội sinh trong cơ chế kháng bệnh loét thân, cành do nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. gây bệnh hại đối với keo lai.

[5]. Phạm Quang Thu (2002), Bước đầu nghiên cứu bệnh khô héo Thông ba lá do tuyến trùng ở Lâm đồng, Thông tin KHKT Lâm nghiệp số 2/2002.

[6]. Pham Quang Thu, Trần Thanh Trăng (2002), Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng với nấm gây bệnh vùng rễ trồng cây Thông con, Thông tin KHKT Lâm nghiệp số 3/2002.

Tài liệu tiếng Anh

[7]. Agnes Joseph Aswathy, B. Jasim, Mathew Jyothis, E. K. Radhakrishnan, (2012), Identification of two strains of Paenibacillus sp. as indole 3 acetic acid-producing rhizome-associated endophytic bacteria from Curcuma longa, School of Biosciences, Mahatma Gandhi University, Priyadarshini Hills, Kottayam, pp 686 – 560, Kerala, India.

[8]. Balick, M.J., Elisabetsky, E. and Laird, S.A. (1996), Medicinal Resources of the Tropical Forest: Biodiversity and its Importance to Human Health, Columbia University Press, New York.

[9]. David L. Hawksworth, Amy Y. Rossman,(1997), Where Are All the Undescribed Fungi?, Phytopathology, Volume 87, Number 9, pp 888-891.

[10]. D.J.Counsins BSc, MTBiol, (1995), Plants with Antimicrobial Properties-volum 2. Antifungal Properties, CAB INTERNATIONAL.

[11]. David Ezra, Uvidelio F. Castillo, Gary A. Strobel, Wilford M. Hess, Heidi Porter, James B. Jensen, Margaret A. M. Condron, David B. Teplow, Joseph Sears, Michelle Maranta, Michelle Hunter, Barbara Weber và Debbie Yaver, Coronamycins, peptide antibiotics produced by a verticillate Streptomyces sp. (MSU-2110) endophytic on Monstera sp., Microbiology, 150, pp. 785 – 793.

[12]. Deborah KB Runyoro, Mecky IN Matee, Olipa D Ngassapa, Cosam C Joseph, Zakaria H Mbwambo, (2006), Screening of Tanzanian medicinal plants for anti-Candida activity, BMC Complement Altern Med.

[13]. E. Christine Davis, Joseph B. Franklin, A. Jonathan Shaw and Rytas Vilgalys, (2003), Endophytic Xylaria (Xylariaceae) among liverworts and angiosperms: phylogenetics, distribution, and symbiosis, American Journal of Botany 90(11),1661-1667.

[14]. Gary Strobel* và Bryn Daisy (2003), Bioprospecting for Microbial Endophytes and Their Natural Products, Department of Plant Sciences, Microbiology and molecular biology reviews.

[15]. Gary A Strobel (2003), Cyclic lipopeptide from Cryptosporiopsis quercina possessing antifungal activity., HMV Sep, US 6613738.

[16]. Guy St. Germain (1995), Identifying Filamentous Fungi, Star Publish Company.

[17]. J. Mohanta, K. Tayung & U. B. Mohapatra (2008), Antimicrobial potentials of endophytic fungi inhabiting three Ethno-medicinal plants of Similipal Biosphere Reserve, India, The Internet Journal of Microbiology. Volume 5 Number 2.

[18]. Jinwi Kim (2000), Isolation and purification of antifulgal compound and lactamase inhibitor from endophytic bacteria, MS thesis, SNU.

[19]. Lee (1993). Acacia mangium growing and utilization, Kuala Lumpur, Malaysia.

[20]. Mario Lozano-Chiu,* Page W. Nelson, Victor L. Paetznick, John H. Rex, (1999), Disk Diffusion Method for Determining Susceptibilities of Candida spp. to MK-0991, Journal of Clinical Microbiology. 37(5), pp 1625–1627.

[21]. Merk & Co. (2005), Fungal diseases pathophysiology Fungal infections in patients with cancer, Merk Medicus Modules Fungal Diseases-Pathophysiology.hmt.

[22]. Miss Yuparet Puangmali (1999). Isolation and selection of some Herbal endophytic Bacteria Capable of Producing L-Asparaginase.

[23]. N S Raviraja, G L Maria, K R Sridhar (2006), Antimicrobial evaluation of endophytic fungi inhabiting medicinal plants of the Western Ghats of India, Engineering In Life Sciences.

[24]. R. X. Tan, W. X. Zou (2001), Endophytes: A Rich Source of Functional Metabolites, Nat. Prod. Rep., 18, pp 448 – 459.

[25]. Rios J.L, Recio M.C., Villar A., (1988), Screening methods for natural products with antimicrobial activity: A review of the literature, Journal of Ethnopharmacology, Volume 23, pp 127–149.

[26]. Ranganathan S, Balajee SA., (2000), Anti-Cryptococcus activity of combination of extracts of Cassia alata and Ocimum sanctum, Mycoses.43(7-8), pp 299-301.

[27]. Sai-Cheong Lee, Chang-Phone Fung, Ning Lee, Lai-Chu See, Jen-Seng Huang, Chi-Jen Tsai, Kuo-Su Chen, Wen-Ben Shieh (2001), Fluconazole Disk Diffusion Test with Methylene Blue- and Glucose-Enriched Mueller-Hinton Agar for Determining Susceptibility of Candida Species, J Clin Microbiol., 39(4), pp 1615–1617.

[28]. T.Taechowisan, S.lumyong (2003), Activity of endophyte actinomycetes from roots of Zingiber oficinale and Alpinia galang against phytopathogenic fungi, Annals of Microbiology, 53 (3), pp 291 – 298.

[29]. U.F. Castillo, G.A. Strobel, E.J. Ford, W.M. Hess, H. Porter, J.B Jensen, H.Albert, R.Robison, M.A. Condron, D.B. Teplow, D. Stevens và D.Yaver (2000), Munumbicins, Wide-spectrums antibiotics produced by Streptomyces NRRL 30562, endophytic on Kennedia nigriscans, Microbiology 148, pp 2675 – 2685.

Nguồn Internet

[30]. http://www.vast.ac.vn/tin-tuc-su-kien/tin-khoa-hoc/trong nuoc/1457

[31]. http://www.grad.cmu.ac.th/abstract/1999/sci/abstract/sci990064.html

Каталог: wp-content -> uploads -> rvn2015
uploads -> 1. Most doctors and nurses have to work on a once or twice a week at the hospital
uploads -> Tác giả phạm hồng thái bài giảng ngôn ngữ LẬp trình c/C++
uploads -> TRƯỜng đẠi học ngân hàng tp. Hcm markerting cơ BẢn lớP: mk001-1-111-T01
uploads -> Hãy là người đầu tiên biết
uploads -> Có chiến lược toàn diện về việc truyền phát tin tức
uploads -> BÀI 1: KỸ NĂng thuyết trình tổng quan về thuyết trình 1 Khái niệm và các mục tiêu
uploads -> CÙng với mẹ maria chúng ta về BÊn thánh thể with mary, we come before the eucharist cấp II thiếU – camp leader level II search
uploads -> ĐÁP Án và HƯỚng dẫn chấM ĐỀ khảo sát chất lưỢng học kỳ II
uploads -> ĐỀ CƯƠng ôn tập bài kiểm tra 15 phút môn hóA 9 LẦN 1 vq1: Nêu
rvn2015 -> Stt tên công trình nckh tác giả

tải về 147.14 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn: