Phần nuôi cấy tế BÀo chương giới thiệu chung và LỊch sử phát triểN

Phần 1. NUÔI CẤY TẾ BÀO

Chương 1. GIỚI THIỆU CHUNG VÀ LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN

1.1. Giới thiệu chung

+ Công nghệ sinh học không phải là một bộ môn khoa học như toán, lý, hoá, sinh học phân tử... mà là một phạm trù sản xuất.

+ Công nghệ sinh học không chỉ tạo ra thêm của cải vật chất, mà còn hướng vào việc bảo vệ và tăng cường chất lượng cuộc sống con người.

+ Thực tế, công nghệ sinh học mang tính ứng dụng, tuy nhiên hàng loạt kỹ thuật của công nghệ sinh học đang là những công cụ sắc bén để nghiên cứu khoa học sinh học và làm sáng tỏ các cơ chế của các hiện tượng sống ở mức phân tử.

Dựa vào việc ứng dụng thành tựu của công nghệ sinh học để phục vụ các chuyên ngành khác nhau trong sản xuất nông nghiệp mà người ta có thể chia công nghệ sinh học nông nghiệp thành 2 loại sau:

Năm 1665, Robert Hooke quan sát thấy tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra khái niệm "tế bào - Cell". Anton Van Leuwen Hoek (1632-1723) thiết kế kính hiển vi khuyếch đại được 270 lần, lần đầu tiên quan sát thấy vi khuẩn, tế bào tinh trùng trong tinh dịch người và động vật. Năm 1838, Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết cơ bản của sinh học gọi là Học thuyết tế bào:

+ Mọi cơ thể sống được cấu tạo bởi một hoặc nhiều tế bào.

+ Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của cơ thể sống, là hình thức nhỏ nhất của sự sống.

+ Tế bào chỉ được tạo ra từ tế bào tồn tại trước đó.

Năm 1875, Oscar Hertwig chứng minh bằng quan sát trên kính hiển vi rằng sự thụ thai là do sự hợp nhất của nhân tinh trùng và nhân trứng. Sau đó, Hermann P., Schneider F.A và Butschli O. đã mô tả chính xác quá trình phân chia tế bào. Năm 1883, Wilhelm Roux lần đầu tiên lý giải về phân bào giảm nhiễm ở cơ quan sinh dục. Từ một tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có thể tái sinh thành một cơ thể sống hoàn chỉnh. Khả năng này của tế bào thực vật được gọi là tính toàn năng. Năm 1902, Haberlandt lần đầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm nhưng không thành công. Năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, 1 hoocmon thực vật đầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào. Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt và White đã đồng thời nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá, mô sẹo có khả năng sinh trưởng liên tục. Năm 1941, Overbeek và cs đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non ở cây cà rốt Datura. Năm 1955, Miller và cs đã phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp của kinetin - một cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân hoá chồi ở mô nuôi cấy. Đến năm 1957, Skoog và Miller đã khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các chất auxin: cytokinin trong môi trường đối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi). Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin (ví dụ: nồng độ IAA/ nồng độ kinetin) nhỏ hơn 1 và càng nhỏ, mô có xu hướng tạo chồi. Ngược lại khi nồng độ IAA/ nồng độ kinetin lớn hơn 1 và càng lớn, mô có xu hướng tạo rễ. Tỷ lệ nồng độ auxin và cytokinin thích hợp sẽ kích thích phân hoá cả chồi và rễ, tạo cây hoàn chỉnh.

Năm 1949, Limmasets và Cornuet đã phát hiện rằng virus phân bố không đồng nhất trên cây và thường không thấy có virus ở vùng đỉnh sinh trưởng. Năm 1952, Morel và Martin đã tạo ra cây sạch bệnh virus của 6 giống khoai tây từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Ngày nay, kỹ thuật này với một số cải tiến đã trở thành phương pháp loại trừ bệnh virus được dùng rộng rãi đối với nhiều loài cây trồng khác nhau. Năm 1952, Morel và Martin lần đầu tiên thực hiện vi ghép in vitro thành công. Kỹ thuật vi ghép sau đó đã được ứng dụng rộng rãi trong tạo nguồn giống sạch bệnh virus và tương tự virus ở nhiều cây trồng nhân giống bằng

phương pháp vô tính khác nhau, đặc biệt là tạo giống cây ăn quả sạch bệnh. Năm 1960, Morel đã thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh các loại địa lan Cymbidium, mở đầu công nghiệp vi nhân giống thực vật.

Năm 1960, Cocking lần đầu tiên sử dụng enzym phân giải thành tế bào và đã tạo ra số lượng lớn tế bào trần. Kỹ thuật này sau đó đã được hoàn thiện để tách nuôi tế bào trần ở nhiều cây trồng khác nhau. Năm 1971, Takebe và cs đã tái sinh được cây từ tế bào trần mô thịt lá (mesophill cell) ở thuốc lá. Năm 1972, Carlson và cs lần đầu tiên thực hiện lai tế bào sôma giữa các loài, tạo được cây từ dung hợp tế bào trần của 2 loài thuốc lá Nicotiana glauca và N. langsdorfii. Năm 1978, Melchers và cs tạo được cây lai soma "Cà chua Thuốc lá" bằng lai xa tế bào trần của 2 cây này. Đến nay, việc tái sinh cây hoàn chỉnh từ tế bào trần hoặc từ lai tế bào trần đã thành công ở nhiều loài thực vật.

Năm 1964, Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà Datura. Kỹ thuật này sau đó đã được nhiều tác giả phát triển và ứng dụng rộng rãi trong tạo dòng đơn bội (1x), dòng thuần nhị bội kép (2x), cố định ưu thế lai (nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn của dòng lai F1 để tạo giống thuần mang tính trạng ưu thế lai).

Năm 1959, Tulecke và Nickell đã thử nghiệm sản xuất sinh khối mô thực vật quy mô lớn (134 lít) bằng nuôi cấy chìm. Năm 1977, Noguchi và cs đã nuôi cấy tế bào thuốc lá trong bioreactor dung tích lớn 20,000 lít. Năm 1978, Tabata và cs đã nuôi tế bào cây thuốc ở quy mô công nghiệp phục vụ sản xuất shikonin. Họ đã chọn lọc được dòng tế bào cho sản lượng các sản phẩm thứ cấp (shikonin) cao hơn. Năm 1985, Flores và Filner lần đầu tiên sản xuất chất trao đổi thứ cấp từ nhân nuôi rễ tơ ở Hyoscyamus muticus. Những rễ này sản xuất nhiều hoạt chất hyoscyamine hơn cây tự nhiên. Hiện nay, công nghệ nuôi cấy tế bào và mô (ví dụ, mô rễ của nhân sâm) trong các bioreactor dung tích lớn đã được thương mại hoá ở mức công nghiệp để sản xuất sinh dược.

Năm 1981, trên cơ sở quan sát các biến dị xảy ra rất phổ biến trong nuôi cấy mô và tế bào với phổ biến dị và tần số biến dị cao, Larkin và Scowcroft đã đưa ra thuật ngữ "biến dị dòng soma" (Somaclonal Variation) để chỉ các thay đổi di truyền tính trạng xảy ra do nuôi cấy mô và tế bào in vitro. Từ các dòng tế bào hoặc cây biến dị di truyền ổn định có thể nhân nhanh, tạo ra các dòng và giống đột biến có năng suất, hàm lượng hoạt chất hữu ích cao, kháng một số các điều kiện bất lợi như bệnh, mặn, hạn,…

Năm	Những phát minh và sự kiện quan trọng
1665	Robert Hooke quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra khái niệm tế bào.
1838	Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào. Schleiden M. J., Arch. Anat., Physiol. U. wiss. Med. (J. Muller), 1838: 137-176; Schwann T., W. Engelman, No. 176 (1910).
1902	Haberlandt lần đầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm nhưng không thành công. Haberlandt G., Sitzungsber Akad. Wiss. Wien, Math.-Naturwiss. Kl., 111: 69-92.
1904	Hannig tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài họ cải Crucifers. Hannig B., Bot. Zeitung, 62: 45-80.
1922	Cho hạt phong lan nảy mầm in vitro. Knudson L., Bot. Gaz., 73: 1-25.
1924	Hình thành callus từ rễ cà rốt trong môi trường có acid lactic. Blumenthal F. and Meyer P. Z. Krebsforsch. 21: 250-252.
1925	Làm hạt phong lan nảy mầm in vitro. Knudson L., Bot. Gaz., 29: 345-379.
1929	Laibach sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất hoà hợp khi lai ở Linum spp. Laibach F., J Hered., 20: 201-208.
1934	White đã thành công khi nuôi cấy mô rễ cà chua trong thời gian dài. White P. R., Plant Physiol., 9: 585-600.
1934	Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, 1 hoocmon thực vật đầu tiên có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào. Kogl F. et al., Z. Physiol. Chem., 228: 90-103.
1936	Nuôi cấy phôi các loài cây hạt trần khác nhau. LaRue C. R., Bull. Torrey Bot. Club, 63: 365-382
1939	Gautheret, Nobecourt và White lần đầu tiên nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá. Gautheret R. J., C. R. Acad. Sci. (Paris), 208: 118-120; Nobecourt P., C. R. Soc. Biol. (Paris), 130: 1270-1271; White P. R., Am. J. Bot., 26: 59-64.
1941	Overbeek và cs đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non ở cà rốt. Overbeek J. van et al., Science, 94: 350-351.
1942	Gautheret lần đầu tiên theo dõi sự hình thành chất trao đổi thứ cấp trong
nuôi cấy mô sẹo thực vật. Gautheret R. J. Bull. Soc. Chim. Biol. 41: 13..
1944	Skoog lần đầu tiên nghiên cứu sự hình thành chồi phụ từ nuôi cấy mô thuốc lá in vitro. Skoog F., Am. J. Bot., 31: 19-24.
1946	Sự tạo cây đầu tiên từ đỉnh chồi ở Lupinus và Tropaeolum. Ball E., Am. J. Bot., 33: 301-318.
1948	Hình thành chồi phụ và rễ ở thuốc lá. Skoog F. and Tsui C., Am. J. Bot., 355: 782-787.
1950	Lần đầu tiên nuôi cấy thành công cây một lá mầm bằng nước dừa. Morel G. C. R. Acad. Sci., 230: 2318-2320.
1951	Nitsch lần đầu tiên nghiên cứu nuôi cấy noãn tách rời in vitro. Nitsch J. P., Am. J. Bot., 38: 566-577.
1951	Skoog nghiên cứu sử dụng các hoá chất điều hoà sinh trưởng và phát sinh cơ quan. Skoog F., Annee Biol., 26: 545-562.
1952	Morel và Martin lần đầu tiên tạo được cây Dahlia sạch virus bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Morel G. and Martin C., C. R. Hebd. Seances Acad. Sci. (Paris), 235: 1324-1325.
1952	Morel và Martin lần đầu tiên thực hiện vi ghép in vitro thành công. Morel G. and Martin C., C. R. Acad. Sci. (Paris), 235: 1324-1325.
1953	Tulecke lần đầu tiên thành công trong nuôi cấy bao phấn và tạo mô sẹo đơn bội từ hạt phấn Ginkgo biloba. Tulecke W. R.., Science, 117: 599-600.
1954	Muir và cs lần đầu tiên tạo được mô sẹo từ mô nuôi dưỡng (nurse culture). Muir W. H. et al., Science, 119: 877-878.
1955	Miller và cs đã phát minh cấu trúc và con đường sinh tổng hợp kinetin. Miller C. et al., J. Am. Chem. Soc., 77: 1392 & 2662-2663.
1957	Skoog và Miller đã khám phá vai trò tỷ lệ nồng độ các chất auxin : cytokinin trong môi trường đối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi). Skoog F. and Miller C. O., In vitro Symp. Soc. Exp. Biol., No. 11: 118-131.
1957	Vasil nghiên cứu nuôi cấy bao phấn tách rời ở Allium cepa. Vasil I. K., Phytomorph., 7: 138-149.
1958	Maheshwari thực hiện nuôi cấy noãn tách rời in vitro ở cây anh túc Papaver somniferum. Maheshwari N., Science, 127: 342.
1958	Maheshwari đã tái sinh thành công phôi soma từ phôi tâm (nucella) trong nuôi cấy noãn Citrus. Maheshwari P. and Rangaswamy N. S., Ind. J. Hort., 15: 275-281.
1959	Tulecke và Nickell thử nghiệm sản xuất sinh khối thực vật quy mô lớn (134 L) bằng nuôi cấy chìm. Tulecke W. and Nickell L. G., Science, 130: 863-864.
1959	Reinert và Steward lần đầu tiên tạo được phôi vô tính từ nuôi cấy mô cà rốt.
1960	Kanta lần đầu tiên thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm ở Papaver rhoeas. Kanta K., Nature, 188: 683-684.
1960	Cocking lần đầu tiên đã sử dụng enzym phân giải thành tế bào để tạo ra số lượng lớn tế bào trần. Cocking E. C., Nature, 187: 927-929.
1960	Morel lần đầu tiên thành công trong nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng để nhân nhanh phong lan. Morel G., Am. Orchid Soc. Bull., 29: 495-497.
1962	Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật- môi trường MS. Murashige T. and Skoog F., Physiol. Plant., 15: 473-497.
1964	Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà rốt. Guha S. and Maheshwari S. C., Nature, 204: 497 and Nature, 212: 97-98 (1966).
1967	Bourgin và Nitsch tạo cây đơn bội từ hạt phấn thuốc lá. Bourgin J. P. and Nitsch J. P., Ann. Physiol. Veg., 9: 377-382 & 10: 69-81.
1969	Phân lập tế bào trần từ nuôi cấy tế bào dịch lỏng (huyền phù) của Hapopappus gracilis. Ericksson T. and Jonassen K., Planta, 89: 85-89
1970	Chon lọc đột biến sinh hoá ở thuốc lá. Carlson P. S., Science, 168: 487-489.
1971	Takebe và cs đã tái sinh được cây từ tế bào trần mô thịt lá ở thuốc lá. Takebe I. et al., Naturewiss., 58: 318-320.
1972	Carlson và cs tạo được cây từ lai xa tế bào trần đầu tiên nhờ dung hợp tế bào trần của 2 loài thuốc lá Nicotiana glauca và N. langsdorfii. Carlson P. S. et al., P. N. A. S. (USA), 69: 2292-2294.
1973	Phát hiện cytokinin có khả năng phá ngủ ở Gerberas. Pierik R. L. M. et al., Sci. Hort., 1: 117-119.
1974	Zaenen và cs phát hiện plasmid Ti đóng vai trò là yếu tố gây u (crown gall) ở cây trồng. Zaenen I. et al., J. Molec. Biol., 86: 109-127; Larebeke N. van et al., Nature, 252: 169-170.
1974	Melchers và Lalib tạo được cây đa bội từ dung hợp tế bào trần đơn bội. Melchers G. and Lalib G., Mol. Gen. Genet. 135: 277-294.
1975	Gengenbach và Green chọn lọc dòng tế bào kháng bệnh nấm Helminthosporium maydis trong nuôi cấy mô sẹo ngô. Gengenbach B. G. and Green C. E., Crop Sci., 15: 645-649.
1977	Chilton và cs chuyển thành công T-DNA vào thực vật. Chilton M. D. et al., Cell, 11: 263-271.
1977	Noguchi và cs nuôi cấy tế bào thuốc lá trong bioreactor 20,000 L. Noguchi M. et al., Plant Tissue Culture & its Biotechnological Application, Springer Verlag, Berlin,: 85-94.
1978	Melchers và cs tạo được cây lai soma cà chua- thuốc lá bằng dung hợp tế bào trần. Melchers G. et al., Carlsburg Res. Comm., 43: 203-218.
1978	Tabata và cs nuôi tế bào thực vật ở quy mô công nghiệp phục vụ sản xuất shikonin (chọn lọc dòng tế bào cho sản lượng các sản phẩm thứ cấp cao hơn). Tabata M. et al., Frontiers of Plant Tissue Culture 1978, Univ. Calgary Press, Calgary,: 213-222.
1979	Marton và cs xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần bằng đồng nuôi cấy tế bào và Agrobacterium. Marton L. et al., Nature, 277: 129-131
1980	Alfermann và cs sử dụng các tế bào nuôi cấy trong chuyển hoá sinh học digitoxin thành digoxin. Alfermann A. W. et al., Planta Medica, 40: 218.
1981	Larkin và Scowcroft đưa ra thuật ngữ "biến dị soma" để chỉ các thay đổi di truyền tính trạng xảy ra do nuôi cấy mô và tế bào in vitro. Larkin P. J. and Scowcroft W. R., Theor. Appl. Gen., 60: 197-214.
1982	Krens đã chyển DNA vào tế bào trần. Krens F. A. et al., Nature, 296: 72-74.
1982	Zimmerman sử dụng kỹ thuật xung điện trong dung hợp tế bào trần. Zimmermann U., Biochim. Biophys. Acta, 694: 227-277.
1983	Công ty Mitsui Petrochemicals lần đầu tiên đã sản xuất chất trao đổi thứ cấp trên quy mô công nghiệp bằng nuôi cấy tế bào dịch lỏng Lithospermum spp. Mitsui Petrochemicals.
1983	Zambryski và cs thiết kế các vector chuyển gen thông qua Agrobacterium. Zambryski P. et al., EMBO J., 2: 2143-2150.
1984	Chuyển gen vào tế bào trần thuốc lá Nicotiana bằng ADN plasmid và tái sinh cây chuyển gen. Paszkowski J. et al., EMBO J., 3: 2717-2722.
1985	Fraley và cs thiết kế vector Ti plasmid đã loại bỏ các gen độc gây hại cho việc chuyển gen vào thực vật. Fraley R. T. et al., Bio/Technol., 3: 629-635.
1985	Horsch và cs chuyển gen vào mảnh lá bằng Agrobacterium tumefaciens và tái sinh cây chuyển gen. Horsch R. B. et al., Science, 227: 1229-1231.
1985	An và cs đã phát triển hệ thống hai vector cho chuyển gen thực vật. An G. et al., EMBO J., 4: 277-284.
1985	Chuyển gen vào tế bào trần cây một lá mầm và hai lá mầm bằng phương pháp điện thẩm. Fromm M. E., P. N. A. S. (USA), 82: 5824-5828.
1985	Flores và Filner lần đầu tiên sản xuất chất trao đổi thứ cấp từ nhân nuôi rễ tơ ở Hyoscyamus muticus. Những rễ này sản xuất nhiều hoạt chất hyoscyamine hơn cây tự nhiên. Flores H. E. and Filner P., Primary & Secondary Metabolism of Plant Cell Cultures. Springer Verlag, (Eds. Neumann K. H., Barz W. and Reinhard E.): 174-186.
1986	Crossway và cs chuyển gen vào tế bào trần thuốc lá bằng vi tiêm AND trực tiếp. Crossway A. et al., Mol. Gen. Genet., 202: 179-185.
1987	Klein và cs đã sử dụng súng bắn gen (Particle gun) mang vi đạn trong chuyển gen và tái sinh cây biểu hiện gen chuyển. Klein T. M. et al., Nature, 327: 70-73.
1987	Bytebier và cs lần đầu tiên đã chuyển gen vào cây một lá mầm (Asparagus) bằng Agrobacterium tumefaciens. Bytebier B. et al., P. N. A. S. (USA), 84: 5345-5349.
1988	Klein và cs tái sinh cây chuyển gen ổn định thông qua phương pháp bắn gen. Klein T. M. et al., P. N. A. S. (USA), 85: 4305-4309.
1991	Sản xuất cây mang gen đầu tiên ở thông Larix decidua bằng chuyển gen qua Agrobacterium rhizogenes. Huang Y. et al., In vitro Cell Dev. Biol., 27: 201-207.
1992	Lúa kháng chất diệt cỏ nhờ chuyển gen vào tế bào trần thông qua PEG. Dutta S. K. et al., Plant Mol. Biol., 20: 619-629.
1993	Kranz và Lorz thực hiện thụ tinh in vitro tạo ra và nuôi cấy phôi hợp tử ở ngô. Các quá trình phát triển và phân hoá của phôi sau đó đã được quan sát dưới kính hiển vi và phân tích biểu hiện của gen nhằm xác định các gen tham gia trong từng giai đoạn phát triển của phôi. Kranz E. and Lorz H., The Plant Cell, 5: 739-746.
1994	Thương mại hoá giống cà chua chuyển gen 'Flavr-Savr'
1998	Hamilton và cs đã phát triển vector mang NST nhân tạo của hai vi khuẩn (BBIC) cho chuyển gen thông qua Agrobacterium (khả năng chuyển 150 kb). Hamilton C. M. et al., P. N. A. S. (USA), 93: 9975-9979

1.3 Sơ lược các kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô

1.3.1. Nuôi cấy phôi.

Raghavan ( 1976, 7980) đã công bố rằng phôi phát triển qua hai giai đoạn dị dưỡng và tự dưỡng. Ở giai đoạn dị dưỡng ( tiền phôi) cần có các chất điều hoà sinh trưởng để phát triển. Trong giai đoạn tự dưỡng sự phát triển của phôi không cần chất điều hoà sinh trưởng.

Đối với nuôi cấy phôi, như đã biết đường đóng vai trò rất quan trọng. Trong nhiều trường hợp thì đường sucrose cho kết qủa tốt hơn các đường khác. Ngoài ra một số chất tự nhiên như nước dừa, nước chiết malt, casein thuỷ phân, là những chất rất cần trong nuôi cấy phôi. Các chất kích thích sinh trưởng như GA₃, auxin, cytokinine thường được dùng nhiều trong nuôi cấy phôi. Auxin thường dùng ở nồng độ thấp. Kinetin có vai trò đặc biệt cho sự phát triển của phôi.

Các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi nuôi cấy in vitro. Thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ và ánh sáng thấp hơn phôi phát triển tự nhiên.

1.3.2. Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời

Wetmore (1946) nuôi cấy đỉnh chồi cây nho dại, cùng với một số tác giả khác, ông đã chứng minh các bộ phận của cây đều có thể nuôi cấy khi gặp điều kiện thuận lợi. Lon và Ball (1946) với thí nghiệm nuôi cấy đỉnh chồi cây măng tây đã cho thấy khi nuôi các bộ phận của cây như lá, thân, hoa thì khả năng tạo mô sẹo nhiều hơn.

Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây là khác nhau nhưng có thể thấy một số yêu cầu chung như nguồn cacbon dưới dạng đường và các muối của các nguyên tố đa lượng ( nito, phospho, kali, calxi) và vi lượng ( Mg, Fe, Mn, Co,Zn,...). Ngoài ra cần một số chất đặc biệt như vitamin (B₁, B₆, B₃, ...) và các chất điều hoà sinh trưởng. Muốn duy trì sinh trưởng và phát triển của cơ quan nuôi cấy cần thường xuyên cấy chuyền qua môi trường mới.

Đối với nuôi cấy mô, ngoài những thành phần dinh dưỡng như đối với nuôi cấy cơ quan tách rời, cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ dưới dạng acide amine, đường và inositol. Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hoà sinh trưởng có vai trò quan trọng hơn vì các mô tách rời không có khử năng tổng hợp các chất này.

1.3.3. Nuôi cấy mô phân sinh

Mô phân sinh thường là các mô đỉnh chồi và cành có kích thước 0,1mm÷ 1cm. Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ các mầm non, các chồi mới hình thành hoặc các cành non.

Đối với nuôi cấy mô phân sinh sự cân bằng giữa các chất điều hoà sinh trưởng rất quan trọng. Muốn kích thích tạo chồi cần bổ sung cytokinine hoặc tổ hợp cytokinine với auxin. Muốn tạo rễ thì bổ sung các auxin như NAA, IAA,...

Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng để loại virus tạo cây sạch virus và nhân giống in vitro. Nuôi cấy mô phân sinh còn được sử dụng để nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan, tạo cây đa bội qua xử lý colchicin.

1.3.4. Nuôi cấy bao phấn

Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn đã phát triển và hoàn thiện nhờ công trình nghiên cứu của Bourgin và Nitsch (1967) trên cây thuốc lá, Niizeki và Oono (1968) trên lúa.Từ cuối những năm 1970 đã nhận được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn trên 30 loại cây. Kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy hạt phấn nuôi cấy có thể phát triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng con đường tạo phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tạo mô sẹo và tạo cơ quan.



Hình 1.1 Một số kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

A. Mô sẹo từ Catharanthus roseus. (B)Nuôi cấy dịch tế bào từ Coryphanta spp. (C) Nốt sần C. roseus. (D) Đầu rễ từ C. roseus. (E)Tái sinh cây từ C. roseus callus. (F) Protoplasts từ Coffea arabica (G) Vi nhân giống của Agave tequilana. (H) Phôi vô tính của cây Coffea canephora. (I) Nuôi cấy rễ cây Psacalium decompositum.

1.3.5. Nuôi cấy tế bào đơn

Ngoài khả năng nuôi cấy các cơ quan và mô thực vật, tế bào thực vật có thể được tách và nuôi riêng rẽ trong môi trường phù hợp. Những công trình về nuôi cấy tế bào đơn được tiến hành từ những năm 50 của thế kỷ XX.

Tế bào đơn có thể nhận được bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý enzym. Mỗi lọai cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy khác nhau.

Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc tế bào, nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau lên các quá trình sinh trưởng, phát triển và phân hoá của tế bào. Nuôi cấy tế bào đơn còn được sử dụng trong chọn dòng tế bào.

1.3.6. Nuôi cấy protoplast

Nuôi cấy protoplats được phát triển nhờ công trình của Cocking (1960). Ông là người đầu tiên dùng enzym để thuỷ phân thành tế bào và tách được protoplast từ tế bào rễ cà chua. Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast có thể tái sinh thành tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh.

Do không có thành tế bào nên protoplast trở nên một đối tượng lý tưởng trong nghiên cứu biến đổi di truyền ở thực vật. Bằng phương pháp dung hợp hai protoplast có thể tạo ra các cây lai soma. Ngoài ra còn có thể sử dụng kỹ thuật dung hợp protoplast để chuyển các bào quan và chuyển gene.

Каталог: Data -> News -> 388 -> files
News -> Nghị quyết của quốc hội số 23/2003/QH11 ngàY 26 tháng 11 NĂM 2003 VỀ nhà ĐẤT DO nhà NƯỚC ĐÃ quản lý, BỐ trí SỬ DỤng trong quá trình thực hiện các chính sáCH
News -> QuyếT ĐỊnh về việc ban hành Quy định về trang phục đối với Sinh viên Trường Đại học Lạc Hồng
News -> BỘ chính trị ĐẢng cộng sản việt nam
files -> Chương MỘt số phưƠng pháp canh tác hiệN ĐẠI 1 Thủy canh
files -> Phần chuyển gen ở thực vật bậc cao chương MỞ ĐẦU
files -> Chương nuôi cấy tế BÀo và chọn dòng tế BÀo nuôi cấy tế bào đơn
files -> Chương những khái niệm cơ BẢn học thuyết tế bào
files -> Chương thu nhận và nuôi cấy phôi in vitro phôi soma

tải về 92.42 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn: