TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hải phân lập VI khuẩn khử sulphate (srb) ĐỂ Ứng dụng trong xử LÝ NƯỚc thải axit từ hoạT ĐỘng khai thác khoáng sảN

Các chất hóa học thường được sử dụng để xử lý AMD gồm CaCO₃, Ca(OH)₂, Na₂CO₃, NaOH và NH₃. Đặc điểm và hiệu quả xử lý khi sử dụng các tác nhân trung hòa này được thể hiện ở bảng 1.4.

Đặc điểm của AMD là có pH thấp, nồng độ sulfate và kim loại cao vượt mức cho phép nhiều lần và mục đích của các công nghệ xử lý AMD là nhằm giải quyết ba yếu tố này. Vi khuẩn khử sulfate (SRB) là các vi khuẩn sinh trưởng kỵ khí, sử dụng sulfate làm chất nhận điện tử cuối cùng để oxy hóa hydro hay các hợp chất hữu cơ và tận thu năng lượng cho mục đích sinh trưởng (phản ứng 1.10).

2CH₂O + SO₄^2 + H⁺  H₂S + 2HCO₃^ (1.10)

Các sản phẩm trao đổi chất của SRB (H₂S và 2HCO₃^) có tác dụng trong việc xử lý AMD, trong đó sulfide hòa tan sẽ tạo phản ứng kết tủa với một số kim loại trong AMD đồng thời tăng pH (phản ứng 1.11), các ion bicarbonate thì làm tăng pH và tính kiềm của nước thải.

H₂S + Me²⁺  MeS + 2H⁺ (1.11)

Phản ứng của các kim loại trong môi trường có sulfide khác nhau, tuy nhiên phần lớn các kim loại chính của AMD được loại khỏi nước thải dưới dạng kết tủa của sulfide kim loại (bảng 1.5).

Để tạo điều kiện cho quá trình khử sufate chiếm ưu thế so với quá trình oxy hóa bằng các chất nhận điện tử khác như oxy, nitrate, Mn⁴⁺ hay Fe³⁺, thế oxy hóa khử của hệ thống xử lý AMD cần duy trì ở mức  200 mV (ở mức oxy hóa khử này quá trình khử Fe³⁺ thành Fe²⁺ cũng diễn ra, tuy nhiên Fe²⁺ sau đó phản ứng với S^2 và kết tủa ở dạng sulfide) (Cabrera và cs, 2006).

Công nghệ xử lý AMD sử dụng SRB là phương pháp thụ động, lợi dụng những quá trình chuyển hóa sinh học vào mục đích loại bỏ chất ô nhiễm. Ưu thế của công nghệ là chi phí thấp, không đòi hỏi theo dõi thường xuyên, có thể triển khai ở những vùng xa, sử dụng những vật liệu thải hoặc tái chế. Tuy nhiên công nghệ cũng có một số yếu điểm, trong đó nổi bật nhất là tính không ổn định đối với lưu lượng thải lớn và đậm đặc, có thể bị ảnh hưởng của thời tiết, đòi hỏi quy trình bảo trì bảo dưỡng thường xuyên, và yêu cầu về diện tích khá lớn. Tuy nhiên, xét về tổng thể công nghệ xử lý AMD sử dụng SRB vẫn được đánh giá là công nghệ hữu hiệu, có hiệu quả cao về kinh tế (Doshi, 2006). Một số quy trình công nghệ được sử dụng rộng rãi trong xử lý AMD từ các mỏ khai thác khoáng sản được liệt kê ở bảng 1.6.

• 
  Bể phản ứng sinh học khử sulfate có thể làm giảm nồng độ các kim loại hòa tan và axit trong khoảng thời gian vài năm, ngay cả ở điều kiện nồng độ nhôm cao. Đối với công nghệ SAPS, nồng độ nhôm cao dẫn tới sự hình thành gipsit (hydroxit nhôm) gây tắc nghẽn các đường dẫn, gây cản trở hệ thống dòng chảy đứng (Rose và cs, 2001; Brookens và cs, 2000). Tương tự, ở công nghệ màng lọc thẩm thấu, sự thay đổi cơ chất có thể làm bít màng. Công nghệ bổ sung hóa chất ít được sử dụng và hiệu quả lâu dài chưa được biết đến.
  
• 
  Tận dụng được một số dạng chất thải hữu cơ như phoi bào, mùn cưa, cỏ khô, rơm, phân ủ, phân động vật, các chất thải hàng ngày, bùn được xử lý một phần, rỉ đường, ...
  
• 
  Phục hồi nhanh các biến đổi về dòng chảy và thay đổi thời tiết. Hiệu suất của bể phản ứng và hóa học của nước không bị ảnh hưởng khi dòng chảy biến đổi. Ảnh hưởng của dòng chảy cao có thể được khắc phục bằng cách dùng van ở bể phản ứng hoặc xả vào các ao để dự trữ nước (Nordwick và cs, 2006). Trong khi đó sự thay đổi của dòng chảy và thời tiết có ảnh hưởng rất lớn đối với quy trình SAPS hay hệ thống màng lọc thẩm thấu.
  
• 
  Có thể tận dụng các mỏ dưới lòng đất bị bỏ hoang để xây dựng bể phản ứng khử sulfate.
  
• 
  Bể phản ứng khử sulfate có khả năng duy trì điều kiện khử tốt hơn các quy trình khác, như SAPS (Rose và cs, 2001) hay bãi lọc kỵ khí (Skousen và cs, 1999).
  

Là quy trình công nghệ dựa trên hoạt động của vi sinh vật, quá trình xử lý AMD bị chi phối bởi các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất sinh lý, sinh hóa của SRB, cụ thể là:

• 
  Nguồn SRB: Trong xử lý AMD, để có nguồn SRB người ta có thể sử dụng phân bò, bùn cống hay bùn cặn từ các hệ thống xử lý nước thải yếm khí và các nguồn khác.
  
• 
  Cơ chất: SRB sử dụng các chất hữu cơ đơn giản (axit hữu cơ, rượu) và H₂ làm chất cho điện tử để khử sulfate (Logan và cs, 2005). Trong xử lý AMD, cacbon đơn giản đôi khi được bổ sung vào hệ thống xử lý để cho SRB phát triển, thông dụng nhất là methanol và ethanol (Tsukamoto và cs, 2004). Để ổn định hệ thống xử lý, trong nhiều trường hợp giá thể được đưa vào cùng với cơ chất hữu cơ. Thực tế cho thấy gỗ (dăm bào) và đá sỏi có tác dụng tốt hơn so với giá thể bằng nhựa (Tsukamoto và cs, 2004).
  

• 
  pH: SRB ưa axit hoặc có tính chống chịu cao đối với môi trường axit có lợi thế trong xử lý AMD. SRB được biết đến với khả năng sinh trưởng trong biên độ pH rộng. Jong & Parry (2006) chứng minh SRB ở pH 6 – 4 có hoạt tính khử sulfate ở mức 553 – 1052 mmol/m³/ngày, nhưng khi pH xuống dưới 3,5 hoạt tính chỉ còn ở mức 3,35 mmol/m³/ngày. SRB chịu axit có thể được đưa vào hệ thống xử lý, tuy nhiên để duy trì hoạt tính cao hơn và tạo điều kiện cho quá trình kết tủa kim loại, pH ban đầu cần điều chỉnh lên mức  4.
  
• 
  Thành phần hóa học của AMD: Nồng độ kim loại cao có thể giảm tốc độ sinh trưởng của quần thể vi khuẩn, giảm tốc độ khử sulfate và ức chế quá trình xử lý (Cabera và cs, 2006). Hỗn hợp chủng SRB (Desulfovibrio spp.) có khả năng chịu được nồng độ kim loại cao hơn so với chủng thuần khiết D. vulgaris (Cabera và cs, 2006). Theo Utgikar và cs, 2001, giới hạn ức chế 100% của nồng độ kim loại trong nước (EC 100) đối với SRB như sau: Cu 12 mg/L, Zn 20 mg/L; ức chế 50% (EC 50) là Cu 10,5 mg/L và Zn 16,5 mg/L. Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cho thấy hỗn hợp SRB bị ức chế ở nồng độ Cu, Cd, Ni: 20 mg/L; Zn: 25 mg/L; Cr: 60 mg/L; Pb: 75 mg/L (Hao và cs, 1994). Trong hệ thống xử lý tồn tại các khu vực có điều kiện vi môi trường khác nhau, do vậy ảnh hưởng của kim loại lên vi SRB có thể không đồng đều.
  
• 
  Nhiệt độ: SRB sinh trưởng ở nhiệt độ thấp nhất là 6C (Tsukamoto và cs, 2004). Ở những nơi có nhiệt độ thấp, việc bổ sung SRB chịu lạnh có thể cải thiện đáng kể tình trạng xử lý của hệ thống xử lý (Higgins và cs, 2003).
  

SRB là vi khuẩn hô hấp kỵ khí, sử dụng sulfate làm chất nhận điện tử cuối cùng để oxy hóa các hợp chất hữu cơ đơn giản và hydro. SRB được tìm ra lần đầu tiên vào năm 1895 do nhà vi sinh vật học người Hà Lan Beijerinck. SRB phổ biến trong môi trường kỵ khí, nơi chúng có vai trò quan trọng trong cả chu trình lưu huỳnh và chu trình cacbon (hình 1.2).

Do sinh ra sulfide là sản phẩm của quá trình trao đổi chất, SRB là nguyên nhân gây ra những vấn đề nghiêm trọng cho các ngành công nghiệp, như khai thác và vận chuyển dầu mỏ, công nghiệp hàng hải, các công trình ngầm. Tuy nhiên, chính đặc tính được coi là có hại này của SRB sau này lại được ứng dụng cho việc phát triển công nghệ xử lý sulfate và kim loại nặng trong AMD.

SRB phân bố rộng rãi trong môi trường tự nhiên có chứa sulfate. Chúng được phân lập hoặc được tìm thấy (dựa trên các dấu vết phân tử) từ các mẫu trầm tích biển (Webster và cs, 2006; Mussmann và cs, 2005; Ravenschlag và cs, 2000; Boschker và cs, 1998), các vực thủy nhiệt (Jeanthon và cs, 2002), mỏ dầu khí (Kniemeyer và cs, 2007), bùn núi lửa (Stadnitskaia và cs, 2005), và phong phú trong các thảm vi sinh vật muối cao, thậm chí ở nơi có nồng độ oxy bão hòa (Minz và cs, 1999; Rissati và cs, 1994). SRB đã được tìm thấy trong môi trường có pH cực trị, như ở các điểm thoát nước thải khai mỏ axit pH2 (Sen, 2001) hay trong các hồ soda có pH10 (Geets và cs, 2006). SRB được tìm thấy và phân lập từ các mỏ dầu (Nilsen và cs, 1996) cũng như sâu dưới bề mặt (Kovacik, 2006). Chúng cũng có mặt trong các trầm tích nước ngọt (Sass và cs, 1998), trong rễ của thực vật (Hines và cs, 1999; Bahr và cs, 2005), các tầng ngập nước và các hệ thống xử lý nước thải kỵ khí (Dar và cs, 2007; Ben-Dov và cs, 2007; Dar và cs, 2005; Wawer và cs, 1997; Oude Elferink và cs, 1994; Ramsing và cs, 1993).

Hầu hết SRB sống tự do, nhưng cũng có một số sống hợp tác với các vi sinh vật khác như cổ khuẩn sử dụng metan (Boetius và cs, 2000), hoặc thậm chí trong một mối quan hệ thân thiết hơn, ví dụ như sống cùng vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh trong cơ thể các động vật thân mềm ở biển (Dubilier và cs, 2001).

1.3.2. Đa dạng về di truyền của SRB

Dựa trên phân tích so sánh trình tự 16S rDNA và đặc tính sinh lý sinh hóa, SRB được chia thành 4 nhóm (hình 1.3).

Hầu hết SRB có nhu cầu dinh dưỡng đơn giản và sinh trưởng tốt trong môi trường có nguồn cacbon/năng lượng ổn định (Postgate, 1984). Nguồn cacbon và điện tử thích hợp đối với SRB bao gồm các axit hữu cơ mạch ngắn như acetate, lactate, pyruvate và rượu (Hao và cs, 1996). Tuy nhiên, lactate và acetate là nguồn điện tử thường được sử dụng nhất trong thí nghiệm phân lập và nuôi cấy SRB (Widdel, Hansen, 1991). Ngoài các hợp chất cacbon hữu cơ, khí hydro có thể làm chất cho điện tử để khử sulfate (Postgate, 1984). Một số SRB có thể sinh trưởng tự dưỡng với H₂ là chất cho điện tử và CO₂ là nguồn cacbon duy nhất (Postgate, 1984).

Phụ thuộc vào cách oxy hóa chất hữu cơ mà SRB có thể được phân chia thành hai nhóm trao đổi chất như sau (Widdel, 1988):

• 
  Nhóm oxy hóa không hoàn toàn: oxy hóa các hợp chất hữu cơ đến acetate. Thuộc nhóm này chủ yếu là các loài thuộc chi Desulfovibrio spp.
  
• 
  Nhóm oxy hóa hoàn toàn: Oxy hóa các hợp chất hữu cơ (bao gồm cả acetate) hoàn toàn thành CO_2.. Trong nhóm này có đa dạng các loài SRB khác nhau, như Desulfobacter spp., Desulfobacterium spp., Desulfosarcina spp.
  

Phản ứng có thể được tóm tắt như sau (Peck và Lissolo, 1988):

SO₄^2 → SO₃^2 → HSO₃^ → HS^ → S^2 (1.12)

Ngoài sulfate, SRB còn có khả năng sử dụng một số hợp chất ở mức oxy hóa cao khác làm chất nhận điện tử trong quá trình tích lũy năng lượng, ví dụ như nitrat (NO₃^), sắt (Fe³⁺), hay thậm chí cả oxy như một số loài thuộc chi Desulfovibrio (Muyzer và Stams, 2008).

Bên cạnh đó phải kể đến một số chất đặc biệt khác có thể làm chất nhận điện tử cho SRB như acrylate, arsenate, chromate hay uranium, các hợp chất chứa clo, theo đó mà SRB có vai trò quan trọng trong các quá trình phân hủy sinh học, loại bỏ chất độc ô nhiễm trong môi trường (Muyzer và Stams, 2008).

1.3.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng của SRB

Nhiệt độ, pH, độ muối. SRB có thể sinh trưởng trong dải pH rộng (5,5 – 9,0), tuy nhiên tốt nhất ở điều kiện kiềm nhẹ với pH trong khoảng 7,0 – 7,8 (Pfennig và cs, 1981). Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu nằm trong khoảng 28 – 38C đối với SRB ưa ấm (Widdel, Pfennig, 1984). Dải muối từ 1 – 4% NaCl thích hợp đối với sự sinh trưởng của hầu hết SRB (Ollivier và cs, 1994). Tuy nhiên, quá trình khử sulfate do vi khuẩn còn được quan sát ở các môi trường khắc nghiệt có nhiệt độ, pH hay độ mặn đặc biệt (Zeikus và cs, 1983).

Nồng độ sulfide. Sulfide có tính độc cao đối với tế bào sinh vật, gây phá hủy các protein và bất hoạt tế bào (Postgate, 1984). Phần lớn vi sinh vật chỉ có khả năng hoạt động ở môi trường không có sulfide hoặc sulfide ở nồng độ thấp. Đối với SRB, sự kết tủa các kim loại nguyên tố vết ở dạng sulfide kim loại là cần thiết để giảm nồng độ sulfide trong môi trường, tạo điều kiện cho sự sinh trưởng (Bharathi và cs, 1990). Ngoài ra, các polymer ngoại bào ở SRB có tác dụng bảo vệ tế bào khỏi sự ảnh hưởng của chất độc ở mức độ nhất định (Teitzel and Parsek, 2003).

Trạng thái của sulfide phụ thuộc vào pH của môi trường. Tại pH 7, sulfide tồn tại ở cả dạng H₂S và S^2-, nhưng chủ yếu là ở dạng H₂S (Perry và Green, 1984). Theo Speece (1983), trong hai dạng tồn tại của sulfide chỉ có H₂S có khả năng đi vào trong màng tế bào và gây ức chế.

Trong môi trường kỵ khí có thế oxy hóa khử thấp và có sẵn nguồn cơ chất phù hợp, SRB cạnh tranh với các vi sinh vật kỵ khí khác như vi khuẩn khử nitrate, vi khuẩn khử Fe(III), vi khuẩn sinh acetate và cổ khuẩn sinh metan (methanogens) (hình 1.5).

Cặp oxy hóa khử SO₄^2/HS^ ở mức khoảng 0,2 mV, sau các cặp O₂/H₂O, NO₃^/N₂, Fe³⁺/Fe²⁺, có nghĩa là năng lượng tạo ra khi oxy hóa một chất hữu cơ bằng sulfate sẽ thấp hơn so với oxy hóa bằng oxy, nitrate hay Fe(III). Tuy nhiên thế oxy hóa khử và hàm lượng sulfate trong môi trường có thể quyết định khả năng cạnh tranh của quá trình khử sulfate với các quá trình khác (Schink và cs, 2006). Bên cạnh đó, sản phẩm trao đổi chất sulfide của SRB còn là yếu tố ức chế thứ cấp đối với các loài vi sinh vật khác khi sinh trưởng trên cùng một loại cơ chất (Stams và cs, 2003).



Hình 1.5. Các cặp oxy hóa khử quan trọng của chu trình chuyển hóa vật chất trong tự nhiên (Thauer và cs, 1977)

Đối với cổ khuẩn sinh methane, SRB sẽ cạnh tranh về các cơ chất chung như hydro và acetate. Trong trường hợp thế oxy hóa khử thấp hơn  0,2 mV thì methanogen chiếm ưu thế do có ái lực với cơ chất cao hơn SRB (Schink và cs, 2006). Tuy nhiên, nếu hàm lượng sulfate trong môi trường ở mức cao thì SRB vẫn có thể cạnh tranh được với methanogen để sử dụng nguồn cơ chất cho quá trình khử sulfate thành sulfide (Brysch và cs, 1987; Weijma và cs, 2002). Giữa các loài SRB, Desulfovibrio spp. có ái lực cao nhất với sulfate, tiếp đó là các loài Desulfobulbus và Desulfobacter (Laanbroek và cs, 1984).

• 
  Mẫu nước thải để làm giàu SRB được thu thập từ một số hệ thống xử lý nước thải ở điều kiện kỵ khí tại Quảng Ngãi, Bình Dương, và Bắc Ninh.
  
• 
  Mẫu nước thải AMD để thử nghiệm xử lý trong mô hình phòng thí nghiệm được thu thập từ mỏ than Tràng Khê, Quảng Ninh.
  

• 
  Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu vi sinh vật đều là những hóa chất có tiêu chuẩn chất lượng cao của các hãng cung cấp lớn như Merck, Sigma.
  
• 
  Hóa chất và một số kit dùng cho sinh học phân tử do các hãng Bioneer – Hàn Quốc, Fermentas – Đức, Qiagen – Mỹ, ABI – Mỹ, BioRad – Mỹ cung cấp.