TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hải phân lập VI khuẩn khử sulphate (srb) ĐỂ Ứng dụng trong xử LÝ NƯỚc thải axit từ hoạT ĐỘng khai thác khoáng sảN

• 
  Sấy màng lọc ở 105^oC trong 2 h, sau đó cân xác định trọng lượng.
  
• 
  Hút 1 ml dung dịch BaCl₂ 0,2 M / HCl 0,2 M vào ống nghiệm thủy tinh.
  
• 
  Bổ sung 1 ml mẫu (đã ly tâm) vào ống nghiệm trên, trộn đều (vortex), giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
  
• 
  Lọc tủa qua màng nitrocellulose nhờ bộ dụng cụ hút chân không.
  
• 
  Lấy màng lọc ra và sấy ở 105^oC trong 2 h, sau đó cân lại màng lọc.
  
• 
  Tính toán lượng chất kết tủa tạo thành, suy ra hàm lượng sulfate trong mẫu theo công thức:
  

Y: Khối lượng màng sau lọc (gam); X: Khối lượng màng trước lọc (gam)

• 
  Dung dịch CuSO₄ 5 mM trong HCl 50 mM
  
• 
  Ống nghiệm thủy tinh nhỏ
  

• 
  Hút 4 ml dung dịch CuSO₄ 5 mM / HCl 50 mM vào ống nghiệm
  
• 
  Thêm 100 µl mẫu vào ống nghiệm, đảo đều.
  
• 
  Đo nhanh ở bước sóng 480 nm.
  
• 
  Đường chuẩn được tiến hành với nồng độ S^2 từ 0 – 20 mM
  

Nồng độ sắt = 200 mg/l (tương đương 3,57 mM)

Nồng độ sulfate = 1320 mg/l (tương đương 13,75 mM)

Giá thể: Phoi bào được lót dưới lớp đáy của bể xử lý

Nguồn vi sinh vật: Dịch làm giàu SRB sau lần cấy truyền thứ 4 (E1-4)

Chu trình xử lý: AMD từ bể điều hòa (1) được chảy vào bể xử lý (2) có chứa cơ chất, giá thể cho vi sinh vật và nguồn SRB. pH và nồng độ sulfate được xác định 1 lần/ ngày. Khi pH tăng lên và nồng độ sulfate giảm đến mức đạt yêu cầu, phần AMD đã được xử lý sẽ được chuyển sang bể chứa 3 theo nguyên lý chảy tràn (hình 2.1).


1

2

3


Hình 2.2. Mô hình xử lý AMD trong phòng thí nghiệm. 1) Bể điều hòa chứa AMD đầu vào; 2) Bể xử lý AMD bằng SRB; 3) Bể lắng chứa nước thải đầu ra.

Mô hình xử lý AMD được hoạt động với nguồn cơ chất cho SRB sinh trưởng được bổ sung từ bên ngoài là methanol hoặc nước thải có hàm lượng hữu cơ cao.

Nguồn nước thải sử dụng để làm giàu SRB gồm có nước trong hồ sinh học xử lý nước thải từ nhà máy chế biến thủy sản ở Bình Dương (E1), nước thải trong bể biogas (E2) và nước thải sau biogas (E3) của nhà máy rượu Hà Nội tại Yên Phong, Bắc Ninh. Các mẫu được lấy từ lớp bùn đáy và nước ở độ sâu 10  20 cm trên bề mặt đáy, giữ trong bình Duran đóng kín và đưa về phòng thí nghiệm.

Vi khuẩn khử sulfate (SRB) được làm giàu từ các mẫu nước thải đã thu thập ở trên trong môi trường khoáng dịch thể chứa sulfate (28 mM) làm chất nhận điện tử duy nhất và Na-Lactate (10 mM) là chất cho điện tử. pH môi trường trong thí nghiệm làm giàu là 6,5 – 6,8, nhiệt độ nuôi cấy là 30C. Sự sinh trưởng của SRB trong các mẫu làm giàu được nhận biết sau 5 – 7 ngày nuôi cấy thông qua sản phẩm trao đổi chất sulfide trong phản ứng tạo kết tủa CuS màu nâu với dung dịch CuCl₂ (xem chương 2). Cấy truyền dịch làm giàu được thực hiện sau mỗi 5 – 7 ngày khi dịch nuôi có mật độ tế bào cao và tạo nhiều sulfide.



Hình 3.1. Hàm lượng sulfide của các mẫu làm giàu ở lần cấy truyền thứ 4. E1-4: Mẫu làm giàu với nước thải từ nhà máy chế biến thủy sản ở Bình Dương sau 4 lần cấy truyền. E2-4: Mẫu làm giàu với nước thải trong bể biogas của nhà máy rượu Hà Nội sau 4 lần cấy truyền. E3-4: Mẫu làm giàu với nước thải sau biogas của nhà máy rượu Hà Nội sau 4 lần cấy truyền.

Sau 4 lần cấy truyền, hàm lượng sulfide trong các mẫu làm giàu với các nguồn nước thải khác nhau được định lượng để so sánh mức sinh trưởng của SRB trong đó (hình 3.1). Có thể nhận thấy mẫu làm giàu với nước thải từ nhà máy chế biến thủy sản ở Bình Dương (E1-4) sau 4 lần cấy truyền có chứa SRB với hoạt tính cao hơn hai mẫu còn lại (hình 3.1).

Trên cơ sở đó, mẫu này (hình 3.2a) được sử dụng để tiến hành phân lập các chủng SRB thuần khiết. Việc phân lập được tiến hành trên dãy ống thạch bán lỏng (1%) chứa môi trường khoáng kỵ khí có chất cho và nhận điện tử tương ứng là lactate và sulfate (Widdel, Bak, 1992). Các khuẩn lạc đơn hình thành trong ống thạch (hình 3.2b) được tách riêng bằng đầu pipet Pasteur và chuyển sang ống nghiệm chứa môi trường dịch thể kỵ khí dành cho SRB.

(a) (b)

Ba chủng SRB được phân lập từ ống pha loãng 10^8 dựa trên hình thái khác nhau của khuẩn lạc (bảng 3.1).

DNA genome của 3 chủng SRB thuần khiết được tách theo phương pháp của Marmur (1961), sau đó sản phẩm được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% (hình 3.4).

Marker SR2 SR3 SR4



5000 bp


Hình 3.4. DNA genome của ba chủng SRB phân lập được

DNA tổng số được dùng làm khuôn trong phản ứng PCR để nhân gen 16S rDNA. Với cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự bảo thủ của gen 16S rDNA của E. coli thì theo lý thuyết sản phẩm PCR thu được phải có độ dài xấp xỉ 1500 bp. Kết quả kiểm tra bằng điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% cho thấy các băng có kích thước khoảng 1500 bp đúng như lý thuyết. Băng DNA rất rõ, không bị đứt gãy, có độ tinh sạch cao, có thể sử dụng trong các phản ứng tiếp theo (hình 3.5).

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PCR purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch bằng Kit được kiểm tra hàm lượng DNA và độ tinh sạch thông qua phương pháp so màu ở bước sóng 260 nm.


Marker SR2 SR3 SR4 ĐC()

1500 bp


Hình 3.5. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuyếch đại gen 16S rDNA của các chủng SRB phân lập được trên gel agarose 1%.

Trình tự gen 16S rDNA được đọc với 3 đoạn mồi 27F, 800F và 1492R (các số tương ứng với các vị trí nucleotide trên gen 16S rDNA ở E. coli). Đoạn gen 16S rDNA gần đủ của mỗi chủng sau đó được tạo ra bằng việc cắt các đoạn trùng lặp và ghép nối các trình tự có được với 3 đoạn mồi nói trên sử dụng công cụ tạo trình tự Contig trong phần mềm BioEdit. Sau đó chuỗi trình tự này được so sánh với các gen 16S rDNA đã được công bố trên ngân hàng gen bằng chương trình BLAST Search, theo đó độ tương đồng của các chủng SRB phân lập được so với các chủng đã công bố như sau:

• 
  Chủng SR2 có độ t­ương đồng 98% so với Desulfomicrobium baculatum.
  
• 
  Chủng SR3 có độ t­ương đồng 98% so với Desulfobulbus propionicus.
  
• 
  Chủng SR4 có độ t­ương đồng 98% so với Desulfovibrio magneticus.
  

Để có thể sử dụng các chủng SRB mới phân lập trong các ứng dụng thực tế, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh lý của chúng, cụ thể là ảnh hưởng của các điều kiện môi trường như nhiệt độ, pH, nồng độ muối tới sinh trưởng cũng như các chất cho và nhận điện tử có thể phục vụ sinh trưởng.

Độ mặn là một trong các yếu tố môi trường quan trọng ảnh hưởng đến sinh lý của vi khuẩn trong tự nhiên, do vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ muối đến sinh trưởng và tốc độ khử sulfate thành sulfide đối với các chủng SRB phân lập được (hình 3.7).

Kết quả cho thấy chủng SR2 tăng sinh tốt ở các nồng độ muối  15 g/l (tương đương với điều kiện nước lợ) và bị ức chế rõ rệt ở các nồng độ muối cao hơn. Hoạt tính sinh học thể hiện qua lượng sulfide tạo ra cũng tương đối thống nhất với việc tạo sinh khối, đạt mức cao nhất tại nồng độ muối 5 g/l, giảm nhẹ ở các nồng độ 10 và 15 g/l, và bị ức chế rõ rệt ở nồng độ muối > 15 g/l.

Khác với chủng SR2, chủng SR3 chỉ tăng sinh tốt ở nồng độ muối 5 và 10 g/l, mức độ tăng sinh thấp hơn đáng kể ở các nồng độ muối < 5 g/l hay > 10 g/l. Tuy nhiên về hoạt tính khử sulfate thành sulfide, chủng SR3 lại thể hiện ở mức khá cao tại tất cả các nồng độ muối nghiên cứu, cao nhất ở hai nồng độ 5 và 10 g/l.

Chủng SR4 tăng sinh tốt và thể hiện hoạt tính khử sulfate cao ở các nồng độ muối < 5 g/l, cả hai đặc tính này đều giảm dần ở các nồng độ muối > 5 g/l.

Như vậy, mặc dù được phân lập từ môi trường nước ngọt nhưng cả ba chủng SRB mới phân lập đều có thể sinh trưởng ở các môi trường có nồng độ muối cao hơn, đặc biệt hai chủng SR2 và SR4 còn sinh trưởng tốt ở nồng độ muối tới 15 g/l, tương đương với môi trường nước lợ. Trong khi hai chủng SR2 và SR4 không thể hiện yêu cầu bắt buộc có muối trong môi trường sinh trưởng thì chủng SR3 lại có yêu cầu này.

3.3.2. Ảnh hưởng của pH trong môi trường

pH là yếu tố rất quan trọng không chỉ ảnh hưởng tới sinh lý của SRB mà còn quyết định khả năng ứng dụng của chúng trong việc xử lý AMD có pH thấp. Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường dịch thể kỵ khí có sulfate (28 mM) làm chất nhận điện tử và lactate (10 mM) làm chất cho điên tử, pH trong khoảng từ 4 – 8 (chỉnh bằng HCl hoặc Na₂CO₃), nuôi ở 30C.

Nồng độ sulfide OD₆₀₀

Nghiên cứu cho thấy (hình 3.8) các chủng SR2, SR4 tăng sinh tốt tại các pH 6, 7, 8, tuy nhiên SR2 chỉ có khả năng tạo sulfide cao ở pH 7 và 8, cao nhất tại pH 8; trong khi đó, tại pH 6 SR4 vẫn có khả năng tạo nhiều sulfide. Khác với 2 chủng SR2 và SR4, chủng SR3 hầu như không sinh trưởng ở pH thấp hơn 7. Chủng SR3 đạt mức sinh trưởng cao nhất và tạo sulfide nhiều nhất ở pH 8.

Như vậy, trong số 3 chủng SRB mới phân lập chỉ có chủng SR4 có khả năng sinh trưởng và thể hiện hoạt tính khử sulfate ở pH 6, tuy nhiên cả 3 chủng đều bị ức chế ở pH < 6.

Nhằm mục đích lựa chọn nguồn SRB phù hợp nhất cho xử lý AMD, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới hỗn hợp ba chủng SRB mới phân lập so với mẫu dịch làm giàu gốc của ba chủng này (hình 3.9).

Kết quả cho thấy hỗn hợp ba chủng SR2, SR3 và SR4 vẫn bị ức chế ở pH < 6, trong khi đó hỗn hợp làm giàu E1-4 lại có thể tăng sinh và thể hiện hoạt tính khá tốt pH 4 và 5. Tuy nhiên cũng có thể thấy hỗn hợp E1-4 mặc dù tăng sinh khá tốt ở pH 4 và 5 nhưng lại không có hoạt tính khử sulfate thành sulfide cao như ở pH  6.

Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường dịch thể kỵ khí có sulfate (28 mM) làm chất nhận điện tử và lactate (10 mM) làm chất cho điên tử, pH 7, nuôi ở dải nhiệt độ từ 15 – 37C.

Kết quả nghiên cứu ở hình 3.10 cho thấy cả 3 chủng SRB mới phân lập đều sinh trưởng và tạo sulfide tốt trong vùng nhiệt độ từ 20 đến 37^oC, cao nhất ở 30^oC. Như vậy, cả 3 chủng SR2, SR3, SR4 đều thuộc nhóm ưa ấm (mesophilic), là các vi khuẩn khử sulfate phổ biến nhất trong tự nhiên.

Nguồn cơ chất thông thường nhất của SRB là các chất hữu cơ đơn giản được hình thành từ quá trình lên men yếm khí như các axit hữu cơ (latate, acetate), rượu (methanol, ethanol) và hydro. Để phân biệt khả năng oxy hóa hoàn toàn và không hoàn toàn ở các chủng SRB mới phân lập, chúng tôi tiến hành thử nghiệm khả năng sinh trưởng của chúng với chất cho điện tử là acetat so sánh với lactate. Ngoài ra, methanol cũng được lựa chọn đưa vào thí nghiệm làm chất cho điện tử vì trong nhiều quy trình xử lý AMD ngoài hiện trường, chất này được bổ sung vào bể phản ứng để làm cơ chất cho SRB thực hiện chức năng khử sulfate, làm tăng pH và kết tủa ion kim loại.

Bên cạnh đó, nhiều loài SRB cũng được biết đến với khả năng sinh trưởng bằng các chất nhận điện tử khác sulfate, phổ biến nhất là nitrate và Fe(III). Hai chất nhận điện tử này do vậy được đưa vào thí nghiệm để kiểm tra đặc tính sinh lý của ba chủng SRB mới phân lập.

Bảng 3.2. Sinh trưởng của SRB với các chất cho và nhận điện tử khác nhau

Kết quả thu được (bảng 3.2) cho thấy ngoài lactate, methanol được oxy hóa bởi cả ba chủng SR2, SR3, SR4 trong quá trình khử sulfate. Tuy nhiên, khả năng sử dụng methanol của các chủng này kém hơn hẳn so với lactate là chất đã được sử dụng để phân lập và nuôi cấy ban đầu, ngoại trừ trường hợp SR4 có thể sử dụng methanol ở mức cao hơn hai chủng còn lại. Với acetate, chỉ có hai chủng SR2 và SR3 có khả năng sử dụng, SR4 hoàn toàn không sinh trưởng với cơ chất này. Kết quả này cũng phù hợp với đặc tính chung của SRB thuộc chi Desulfovibrio như SR4, là các loài oxy hóa không hoàn toàn điển hình (Widdel, Bak, 1992).

Về thí nghiệm với các chất nhận điện tử khác nhau, chủng SR3 chỉ sinh trưởng với sulfate làm chất nhận điện tử cuối cùng, trong khi đó hai chủng SR2 và SR4 còn sinh trưởng tốt với nitrate, đặc biệt SR4 còn khử được cả Fe (III) thành Fe(II). Khả năng khử Fe(III) thành Fe(II) có thể giúp SR4 giảm được sự ức chế của sulfide tạo ra trong môi trường nhờ phản ứng tạo kết tủa FeS được thúc đẩy.

3.4. Thử nghiệm xử lý AMD trên mô hình phòng thí nghiệm

Quá trình xử lý AMD trên mô hình phòng thí nghiệm được tiến hành theo mẻ (bảng 3.3). Nguồn SRB (seeding) bổ sung ban đầu được lựa chọn là dịch làm giàu E1-4 do khả năng thích nghi và sinh trưởng, tạo sulfide của quần xã SRB trong mẫu này với điều kiện pH thấp. Do hàm lượng COD trong AMD ban đầu rất thấp, không đủ cho SRB sinh trưởng nên nguồn cơ chất hữu cơ bên ngoài được chủ động bổ sung vào bể xử lý. Trong nghiên cứu này, 2 loại cơ chất khác nhau được thử nghiệm là (i) methanol và (ii) nước thải có hàm lượng hữu cơ cao.

Trong mô hình xử lý AMD với cơ chất là methanol (MH1), pH của nước thải tăng chậm và chỉ đạt mức 6 sau 7 ngày xử lý. Bên cạnh đó, nồng độ sulfate giảm ít và nồng độ Fe(II) sau xử lý cũng còn ở mức rất cao (159,7 mg/l) (hình 3.12).

Như vậy, sử dụng methanol làm cơ chất cho SRB trong trường hợp mô hình xử lý AMD này không đạt hiệu quả mong muốn. Nguyên nhân có thể do (i) quần xã SRB trong mẫu làm giàu E1-4 kém thích nghi với loại cơ chất này và (ii) methanol bị cạnh tranh bởi các nhóm vi khuẩn kỵ khí khác trong bể xử lý, do vậy quần xã SRB không thể hiện được mức sinh trưởng cũng như hoạt tính cao như mong muốn.



Hình 3.12. Mô hình xử lý AMD với cơ chất bổ sung là methanol (10 mM)

3.4.2. Xử lý AMD trong điều kiện bổ sung nước thải giàu hữu cơ làm cơ chất

Trong mô hình xử lý AMD với cơ chất bổ sung là nước thải giàu hữu cơ (MH2), nồng độ sulfate giảm đáng kể từ 13,75 mM giảm xuống còn 4,5 mM sau 7 ngày xử lý chứng tỏ hoạt động trao đổi chất của SRB trong đó ở mức khá cao. Nhờ lượng sulfide sinh ra đáng kể nên pH của nước thải tăng cao, từ pH 4 đạt pH 8,2 (hình 3.13). Bên cạnh đó, nồng độ Fe(II) cũng giảm đáng kể, từ 200 mg/l còn 36 mg/l.

Như vậy nước thải có hàm lượng hữu cơ cao có khả năng sử dụng làm cơ chất tốt cho vi khuẩn khử sulfate trong bể phản ứng xử lý AMD. Việc kết hợp nước thải hữu cơ để xử lý AMD có ý nghĩa quan trọng trong việc giảm giá thành công nghệ, đồng thời góp phần bảo vệ môi trường bởi các loại nước thải hữu cơ như nước thải từ chăn nuôi, chế biến thực phẩm, nước thải sinh hoạt.