TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hải phân lập VI khuẩn khử sulphate (srb) ĐỂ Ứng dụng trong xử LÝ NƯỚc thải axit từ hoạT ĐỘng khai thác khoáng sảN

Nghiên cứu được thực hiện tại phòng Sinh thái Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học – ĐHQGHN, sử dụng các thiết bị chuyên môn dùng trong vi sinh vật học, sinh học phân tử và hóa phân tích đạt tiêu chuẩn quốc tế.

• 
  Bể ổn nhiệt Jeio Tech, Hàn Quốc
  
• 
  Máy đo pH Horiba, Nhật Bản
  
• 
  Máy ly tâm Eppendoff, Đức
  
• 
  Máy ly tâm siêu tốc Beckman Counter, Mỹ
  
• 
  Máy PCR Eppendoff, Đức
  
• 
  Máy điện di ngang Nyx Technik, Mỹ
  
• 
  Máy DGGE Dcode^TM universal Mutation Detection System BioRad, Mỹ
  
• 
  Máy GelDoc BioRad, Mỹ
  
• 
  Máy đo quang phổ UV – Vis (GBC instrument, Úc)
  
• 
  Kính hiển vi quang học Olympus, Nhật Bản
  
• 
  Kính hiển vi phản pha và huỳnh quang Zeiss, Đức
  

DNA tổng số của mẫu làm giàu và các mẫu thí nghiệm xử lý AMD trên mô hình được tách chiết theo phương pháp do Zhou và cộng sự (1996) mô tả với cải biến về nồng độ đệm phosphate (tăng từ 100 mM lên 120 mM) trong đệm tách (gồm: 100 mM Tris (pH 8);100 mM EDTA (pH 8); 120 mM đệm phosphate (Na₂HPO_4­/NaH₂PO₄); 1,5 M NaCl; 1% CTAB). Các bước tiến hành như sau:

• 
  Trộn 2 ml mẫu môi trường với 5,4 ml đệm tách DNA trong ống falcol 15 ml.
  
• 
  Phá tế bào bằng phương pháp sốc nhiệt trong nitơ lỏng và bể ổn nhiệt ở 37^oC, lặp lại 5 lần.
  
• 
  Bổ sung 40 µl proteinase K (10 mg/ml), lắc ngang với tốc độ 225 vòng/phút trong 30 phút ở 37^oC.
  
• 
  Thêm 600 µl SDS (20%), ủ ở 65^oC trong 2 giờ, 25 phút đảo lộn đầu một lần.
  
• 
  Bổ sung với lượng tương đương PCI về thể tích, sau đó trộn đều. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
  
• 
  Thu lấy phần dịch phía trên sang ống mới, lặp lại bước trên 1 lần.
  
• 
  Thu lấy phần dịch phía trên sang ống mới, bổ sung 0,6 lần thể tích isopropanol, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.
  
• 
  Ly tâm thu kết tủa DNA ở 12000 vòng/ phút trong 25 phút ở nhiệt độ phòng. Đổ phần dịch ở trên, rửa kết tủa với 10 ml ethanol 80%, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.
  
• 
  Đổ ethanol, để khô ở nhiệt độ phòng.
  
• 
  Hòa tan DNA trong 50 µl nước MQ đã khử trùng, chuyển DNA sang ống eppendorf 1,5 ml và giữ ở 20^oC.
  

• 
  1 ml dịch tế bào được ly tâm 5000 – 10 000 vòng/ phút trong 5 phút, sau đó rửa với 1 ml đệm TE (pH 8) rồi hòa tế bào trong 0,5 ml 5 mM EDTA (pH 8).
  
• 
  Thêm 50 µl lysozym (40 mg/ml), trộn đều, ủ trong bể ổn nhiệt ở 37^oC trong 1 giờ.
  
• 
  Thêm 50 µl SDS (20%) và 50 µl proteinase K (4 mg/ml), trộn đều và ủ trong bể ổn nhiệt ở 55^oC trong 1 giờ.
  
• 
  Thêm 400 µl PCI, trộn đều trong 1- 3 phútt, ly tâm 13000 vòng/phút ở 4^oC trong 15 phút. Lặp lại bước vừa rồi thêm 1 lần.
  
• 
  Chuyển lớp dịch trong ở trên sang ống eppendorf mới. Thêm 1/10 thể tích dung dịch 3M Na-acetate (pH 5,2) và 2 lần thể tích dung dịch 2-propanol (đó để lạnh -20^oC), trộn đều và giữ ở -20^oC trong vòng 15 phút đến 1 giờ.
  
• 
  Ly tâm 13000 vòng/phút ở 4^oC trong 15 phút, chắt phần dịch phía trên để thu kết tủa DNA.
  
• 
  Rửa DNA trong ethanol 70% (đó để lạnh 20^oC) trong 1 phút, ly tâm 13 000 vòng/ phút, đổ cồn, làm khô DNA ở nhiệt độ phòng.
  
• 
  Hòa tan DNA trong 50 µl MQ vô trùng (hoặc đệm TE) và bảo quản tại 20C cho các thí nghiệm tiếp theo.
  

Gen 16S rDNA (1500 bp) của các chủng SRB thuần khiết được khuếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) và 1492R (GGTTACCTTGTTACGACT T) ( Weisburg và cs, 1991) với thành phần và chu trình phản ứng ở bảng 2.6.

Thành phần phản ứng	Thể tích (µl)		Nhiệt độ (oC)	Thời gian	Số chu kỳ
H2O MQ	13,5		94	3 phút
10x buffer	2,5		94	30 giây	35
BSA (3 mg/ml)	2,5		55	45 giây
MgCl2 (20 mM)	2		72	1,5 phút
dNTP (2,5 mM)	2		72	7 phút
Mồi 27F (50 pmol/µl)	0,5
Mồi 1492R (50 pmol/µl)	0,5
Taq polymerase (5u/µl)	0,5
DNA Khuôn	1
Tổng thể tích phản ứng	25

• 
  Dung dịch HCl 25% (rửa dụng cụ): Dụng cụ được rửa bằng HCl 25% và tráng bằng nước cất trước khi sử dụng
  
• 
  Dung dịch H₂SO₄ loãng (hạ pH): H₂SO₄ đặc : nước = 1 : 4 (thể tích).
  
• 
  Dung dịch ammonium acetate 5,2 M (đệm):
  

CH₃COOH 50 ml

Nước cất đủ 100 ml

• 
  Dung dịch hydroxyl ammonium chloride 1,4 M (khử Fe³⁺ thành Fe²⁺)
  

Nước cất đủ 100 ml

• 
  Dung dịch phenanthrolin 21 mM (Tạo phức):
  

Nước cất đủ 100 ml

(Bảo quản trong lọ tối, hạn sử dụng trong 1 tuần)

• 
  Dung dịch chuẩn:
  

HCl 25% 6,25 ml

Nước cất đủ 100 ml

Tiến hành:

• 
  Sau khi thu mẫu, lập tức hạ pH tới 1 bằng dung dịch H₂SO₄ loãng (1% thể tích).
  
• 
  Thêm vào 50 ml mẫu 5 ml dung dịch ammonium acetate và 2 ml dung dịch hydroxyl ammonium chloride, trộn đều bằng vortex, hỗn hợp phải có pH nằm trong khoảng 3,4 - 5,5 (tối ưu là 4,5).
  
• 
  Thêm 2 ml dung dịch phenanthrolin, trộn đều.
  
• 
  Thêm nước cho tới 100 ml, trộn đều. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
  
• 
  Đo OD tại bước sóng 510 nm.
  
• 
  Đường chuẩn được tiến hành với nồng độ Fe(II) từ 5 - 50 µM.
  

• 
  Dung dịch BaCl₂ 0,2 M trong HCl 0,2 M
  
• 
  Ống nghiệm thủy tinh nhỏ
  
• 
  Màng lọc nitrocellulose 0,2 µm
  
• 
  Bộ dụng cụ hút chân không