Sự sản xuất hàng hóa và dịch vụ ở quy mô công nghiệp nhờ việc sử dụng sinh vật, các hệ thống sinh học và các quá trình sinh học



tải về 284 Kb.
trang4/4
Chuyển đổi dữ liệu30.08.2016
Kích284 Kb.
#28470
1   2   3   4

Từ Bảng 6 cho thấy: băng 100 bp trong thang chuẩn thực chất là tổ hợp của hai băng ADN kích thước 106 bp và 107 bp (chênh lệch chỉ 1 nucleotide); băng ADN kích thước 300 bp không có; băng 200 bp và 600 bp là tổ hợp gồm hai băng ADN kích thước chênh nhau lớn nhất 8 nucleotide (giảm đi 1/2 so với sử dụng EcoRI). Như vậy sử dụng enzyme HpaII thay cho EcoRI đã khắc phục được hầu như toàn bộ sự chênh lệch giữa các băng trong cùng một kích thước. Bốn kích thước chỉ gồm một băng ADN duy nhất. Tuy nhiên, một vấn đề được đặt ra là sản phẩm cắt không hoàn toàn plasmid pJET1.2-8×100-2 bằng HpaII không thu được băng ADN kích thước 300 bp. Ngoài ra, có tới 12 vị trí cắt của enzyme HpaII trên vector pJET1.2 (Hình 16). Do đó, không thể sử dụng plasmid pJET1.2-8×100-2 cho phản ứng cắt không hoàn toàn bằng HpaII tạo thang chuẩn.

Để khắc phục những khó khăn này, cũng như thực hiện mục đích tăng số lượng băng thang chuẩn 100 bp, chúng tôi thiết kế cặp mồi khuếch đại đoạn ADN kích thước 1000 bp. Sản phẩm PCR được cắt không hoàn toàn bằng enzyme HpaII sẽ tạo ra thang chuẩn 100 bp gồm 10 băng, kích thước từ 100 bp đến 1000 bp.



Hình 16. Các vị trí cắt của enzyme HpaII trên vector pJET1.2 [36].

3.4. SẢN XUẤT THANG CHUẨN ADN 100 bp

3.4.1. Khuếch đại đoạn 1000 bp

Bổ sung băng 300 bp, 900 bp, 1000 bp cho sản phẩm thang chuẩn ADN 100 bp, chúng tôi thiết kế mồi xuôi pJET-800-F (cách vị trí cắt đầu tiên của HpaII trên đoạn ADN chèn trong pJET1.2-8×100-2) và mồi ngược pJET-800-R (cách vị trí cắt cuối cùng của HpaII trên đoạn ADN chèn).



  • Sơ đồ thiết kế mồi pJET-800-F/R

- Vị trí thiết kế hai mồi khuếch đại đoạn ADN kích thước 1000 bp trên vector pJET1.2-8×100-2 (Hình 17).

Hình17. Vị trí mồi pJET-800-F/R trên vector pJET1.2-8×100-2.



  • Khuếch đại đoạn ADN kích thước 1000 bp

Phản ứng PCR với khuôn là plasmid pJET1.2-8×100-2 sử dụng cặp mồi pJET-800-F/R được thực hiện ở nhiều điều kiện khác nhau để tìm ra điều kiện tối ưu nhất cho phản ứng.

Ban đầu phản ứng PCR sử dụng khuôn là plasmid pJET1.2-8×100-2 được pha loãng 10-1; 10-2; 10-3; 10-4 lần, nhiệt độ gắn mồi 600C, thành phần và điều kiện phản ứng như sau:



Thành phần phản ứng

Thể tích

(µl)

Điều kiện

H2O

10,6

- Biến tính 940C trong 5 phút ở giai đoạn đầu

- Chu trình lặp lại 40 lần:



  • Biến tính 940C trong 30 giây

  • Gắn mồi 600C trong 30 giây

  • Tổng hợp 720C trong 60 giây

- Tổng hợp 720C trong 5 phút ở giai đoạn sau cùng

Đệm Taq ADN polymerase 10X

1,5

MgCl2 (25 mM)

0,3

dNTP mix (2 mM mỗi loại)

0,5

Taq ADN polymerase (1 u/µl )

0,5

Mồi pJET-800-F (10 µM)

0,3

Mồi pJET-800-R (10 µM)

0,3

ADN

1,0

Tổng thể tích

15,0










Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên agarose 1% (Hình 18).

Hình 18. Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 1000 bp ở bốn độ pha loãng khuôn ADN trên agarose 1%. L: ADN ladder 500 bp; 1: Khuôn pha loãng 10-4; 2: Khuôn pha loãng 10-3; 3: Khuôn pha loãng 10-2; 4: Khuôn pha loãng 10-1; 5: Đối chứng âm.

Ảnh điện di trên Hình 18 cho thấy sản phẩm khuếch đại đoạn 1000 bp có nhiều băng phụ. Phản ứng PCR được tăng nhiệt độ gắn mồi lên 660C với 6 độ pha loãng khuôn ADN: 10-1; 10-2; 10-3; 10-4; 10-5; 10-6 lần. Thành phần và điều kiện phản ứng được chúng tôi thiết lập như sau:


Thành phần phản ứng

Thể tích

(µl)

Điều kiện

H2O

10,6

- Biến tính 940C trong 5 phút ở giai đoạn đầu

- Chu trình lặp lại 40 lần:



  • Biến tính 940C trong 30 giây

  • Gắn mồi 660C trong 30 giây

  • Tổng hợp 720C trong 60 giây

- Tổng hợp 720C 5 phút ở giai đoạn sau cùng

Đệm Taq ADN polymerase 10X

1,5

MgCl2 (25 mM)

0,3

dNTP mix (2 mM mỗi loại)

0,5

Taq ADN polymerase (1 u/µl )

0,5

Mồi pJET1.2-800-F (10 µM)

0,3

Mồi pJET1.2-800-R (10 µM)

0,3

ADN

1,0

Tổng thể tích

15,0










Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên agarose 1% (Hình 19).

Hình 19. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 1000 bp ở nhiệt độ gắn mồi 660C sử dụng 6 độ pha loãng khuôn ADN. L: ADN ladder 500 bp; 1: Khuôn pha loãng 10-1; 2: Khuôn pha loãng 10-2; 3: Khuôn pha loãng 10-3; 4: Khuôn pha loãng 10-4; 5: Khuôn pha loãng 10-5; 6: Khuôn pha loãng 10-6; 7: Đối chứng âm.

Từ ảnh điện di nhận thấy độ pha loãng 10-6 tương ứng với nồng độ ADN khoảng 1 pg/µl (6), nhiệt độ gắn mồi 660C là hoàn toàn tối ưu. Sản phẩm PCR mang tính đặc hiệu cao, mất hoàn toàn băng phụ, băng 1000 bp sáng rõ.

Như vậy, chúng tôi đã chuẩn hóa được điều kiện PCR tối ưu, với thành phần phản ứng được trình bày cụ thể như sau:



Thành phần phản ứng

Thể tích

(µl)

Điều kiện

H2O

10,6

- Biến tính 940C trong 5 phút ở giai đoạn đầu

- Chu trình lặp lại 40 lần:



  • Biến tính 940C trong 30 giây

  • Gắn mồi 660C trong 30 giây

  • Tổng hợp 720C trong 60 giây

- Tổng hợp 720C trong 5 phút ở giai đoạn sau

Đệm Taq ADN polymerase 10X

1,5

MgCl2 (25 mM)

0,3

dNTP mix (2 mM mỗi loại)

0,5

Taq ADN polymerase (1 u/µl )

0,5

Mồi pJET-800-F (10 µM)

0,3

Mồi pJET-800-R (10 µM)

0,3

ADN

1,0

Tổng thể tích

15,0










Sản phẩm PCR được điện di trên agarose 1% (Hình 20).

Hình 20. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 1000 bp sử dụng cặp mồi pJET-800-F/R với khuôn plasmid pJET1.2-8×100-2 trên agarose 1%. L: ADN ladder 500 bp; 1: Sản phẩm PCR; 2: Đối chứng âm.

Như vậy chúng tôi đã khuếch đại thành công lượng lớn đoạn ADN kích thước 1000 bp. Sản phẩm PCR được tinh sạch theo kít của QIAGEN [20] loại bỏ dimer và các thành phần khác, sau đó được cắt không hoàn toàn tạo thang chuẩn 100 bp.

3.4.2. Phản ứng cắt không hoàn toàn đoạn 1000 bp

Đoạn ADN kích thước 1000 bp sau khi tinh sạch qua cột sẽ được xác định nồng độ thích hợp cho phản ứng cắt không hoàn toàn bằng enzyme HpaII. Phản ứng được thực hiện ở các nồng độ ADN và thời gian ủ khác nhau, để tìm thành phần và điều kiện tối ưu cho phản ứng cắt không hoàn toàn các đoạn 1000 bp tạo thang chuẩn 100 bp.



  • Chuẩn thời gian cắt

Trước tiên chúng tôi tiến hành tìm thời gian thực hiện phản ứng cắt không hoàn toàn đoạn 1000 bp sao cho sản phẩm có đủ 10 băng ADN kích thước từ 100 bp đến 1000 bp. Dựa vào nồng độ các đoạn ADN trong ADN ladder 100 bp của Takara và New England Biolab, ước tính mỗi băng ADN trong thang chuẩn sản xuất sẽ có nồng độ 15 ng, do đó nồng độ ADN được chọn ban đầu là 150 ng. Hỗn hợp phản ứng được thiết lập với thành phần gồm:

Đệm 10X

1,5 µl

ADN kích thước 1000 bp

3,0 µl (150 ng)

HpaII 10 u/µl

0,05 µl

Thêm nước để có tổng thể tích

15,0 µl







Phản ứng được diễn ra ở 370C tại ba thời gian: 1 phút, 3 phút và 5 phút, enzyme sau đó bị bất hoạt tại 700C, 10 phút. Sản phẩm được điện di trên gel polyacrylamide 6% (Hình 21).

Hình 21. Ảnh điện di sản phẩm cắt không hoàn toàn đoạn 1000 bp bằng enzyme HpaII trên gel polyacrylamide 6% tại các thời gian phản ứng khác nhau. 1: Phản ứng cắt 1 phút; 2: Phản ứng cắt 3 phút; 3: Phản ứng cắt 5 phút; L: ADN ladder 100 bp.

Hình 21 cho thấy tại thời điểm 1 phút (1), các đoạn ADN kích thước lớn chưa được cắt còn nhiều, do đó các đoạn ADN kích thước nhỏ rất mờ. Tại thời điểm 5 phút (3), các đoạn ADN lớn đã tham gia hoàn toàn vào phản ứng cắt, do đó các băng ADN kích thước nhỏ rõ nét, nhưng băng ADN kích thước lớn hơn 600 bp hầu như không thể quan sát. Thời gian diễn ra phản ứng cắt trong 3 phút (2) là điều kiện thích hợp để có thể quan sát được các băng ADN kích thước từ 100 bp đến 1000 bp.


  • Chuẩn nồng độ ADN

Nồng độ ADN 150 ng được sử dụng trong phản ứng cắt cho các băng sáng, do đó quyết định lặp lại phản ứng sử dụng bốn nồng độ ADN khác nhau: 50 ng (1,0 µl); 100 ng (2,0 µl); 150 ng (3,0 µl); 250 ng (5,0 µl) với mong muốn chọn được nồng độ ADN ít nhất, nhưng sản phẩm cắt lại cho băng sáng và rõ nét nhất. Phản ứng diễn ra ở 370C, 3 phút và bất hoạt enzyme ở 700C, 10 phút. Thành phần phản ứng trình bày trong Bảng 7.

Bảng 7. Thành phần phản ứng cắt không hoàn toàn đoạn 1000 bp bằng HpaII ở 4 nồng độ ADN.

Đệm 10X

1,5 µl

ADN kích thước 1000 bp

1,0 µl (50 ng)

2,0 µl (100 ng)

3,0 µl (150 ng)

5,0 µl (250 ng)



HpaII 10 u/µl

0,05 µl

Thêm nước để có tổng thể tích

15,0 µl







Sản phẩm cắt được điện di trên gel polyacrylamide 6% (Hình 22).

Hình 22. Điện di sản phẩm cắt không hoàn toàn đoạn 1000 bp bằng HpaII tại 4 nồng độ ADN khác nhau trên gel polyacrylamide 6%. L: ADN ladder 100 bp; 1: Nồng độ ADN 250 ng; 2: Nồng độ ADN 150 ng; 3: Nồng độ ADN 100 ng; 4: Nồng độ ADN 50 ng.

Từ nồng độ 150 ng (2) trở lên đã có thể quan sát rõ các băng ADN trong hỗn hợp sản phẩm cắt. Để đảm bảo độ nét các băng ADN trong thang chuẩn sản xuất, chúng tôi quyết định chọn nồng độ ADN 200 ng cho phản ứng cắt.


  • Điều kiện cắt tối ưu

Chúng tôi đã thiết lập được thành phần và điều kiện phản ứng cắt tối ưu đoạn ADN 1000 bp bằng enzyme HpaII như sau:

Đệm 10X

1,5 µl

ADN kích thước 1000 bp

4,0 µl (200 ng)

HpaII 10 u/µl

0,05 µl

Thêm nước để có tổng thể tích

15,0 µl







Phản ứng diễn ra ở 370C, 3 phút và sau đó được bất hoạt ngay ở 700C, 10 phút. Kết quả được điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 6% (Hình 23).

Hình 23. Ảnh điện di sản phẩm phản ứng cắt không hoàn toàn đoạn 1000 bp bằng HpaII trên gel polyacrylamide 6%. 1: Sản phẩm phản ứng cắt không hoàn toàn đoạn 1000 bp bằng HpaII; L: ADN ladder 100 bp.

Từ ảnh điện di cho thấy các băng ADN trong sản phẩm cắt không rõ nét và có sự chênh lệch đáng kể kích thước băng so với thang chuẩn thương mại. Hiện tượng này là do sản phẩm phản ứng cắt được điện di mà chưa tinh sạch loại muối và các thành phần khác. Để thu được thang chuẩn 100 bp hoàn chỉnh, sản phẩm cắt phải được qua bước tinh sạch loại hoàn toàn các thành phần trong phản ứng.

3.4.3. Tinh sạch sản phẩm cắt tạo thang chuẩn ADN SY - 100

Sản phẩm cắt không hoàn toàn đoạn 1000 bp bằng HpaII sau khi tinh sạch (kít Qiagen [20]) sẽ tạo thang chuẩn ADN kí hiệu là SY - 100. Sản phẩm thang chuẩn ADN SY - 100 được điện di trên gel polyacrylamide 6%. Kết quả thể hiện trên Hình 24.



Hình 24. Ảnh điện di thang chuẩn ADN SY - 100 sau tinh sạch trên gel polyacrylamide 6%. 1: Thang chuẩn ADN SY - 100 tinh sạch; L: ADN ladder 100 bp.

Kết quả điện di chứng minh rằng cần loại bỏ các thành phần có trong phản ứng cắt để các băng ADN điện di đúng với kích thước của chúng.

Chúng tôi đã thiết kế thành công thang chuẩn ADN SY - 100 gồm tổ hợp 18 băng ADN được trình bày trong Bảng 8.



Bảng 8. Tổ hợp băng trong thang chuẩn ADN SY - 100.

Enzyme

Trình tự cắt

Các băng trong thang chuẩn (bp)

Tổ hợp băng (bp)

HpaII

CˇCGG



100

106 107

200

203 211

300

305 315

400

395

500

499

600

596 604

700

698 700 708

800

802 805

900

907 909

1000

1009













Sự chênh lệch lớn nhất của các băng trong cùng một kích thước là 10 nucleotide, sự chênh lệch này không thể quan sát được khi điện di trên nồng độ gel thích hợp cho thang chuẩn 100 bp: gel agarose 1,7% đến 2,5%; gel polyacrylamide 4% đến 8% [33, 45] (Hình 25).

Hình 25. Ảnh điện di 200 ng thang chuẩn ADN SY - 100 (1) và 125 ng ADN ladder 100 bp - Takara (L) trên bốn nồng độ gel khác nhau. A: Agarose 1,7%; B: Agarose 2,5%; C: Polyacrylamide 4%; D: Polyacrylamide 8%.

Thang chuẩn 100 bp mà chúng tôi thiết kế là sự kết hợp giữa phương pháp ADN tái tổ hợp và phương pháp PCR. Áp dụng phản ứng PCR, Multiplex PCR trong sản xuất thang chuẩn 100 bp, thường phải sử dụng tới 10 cặp mồi khác nhau để khuếch đại 10 đoạn ADN với kích thước từ 100 bp đến 1000 bp, sau đó tinh sạch, xác định tỷ lệ nồng độ để phối trộn tạo thang chuẩn hoàn chỉnh [7, 24]. Trong nghiên cứu này, đoạn 1000 bp được khuếch đại bởi một cặp mồi duy nhất sử dụng khuôn ADN là vector tái tổ hợp, sau khi tinh sạch được cắt không hoàn toàn bằng enzyme cắt giới hạn tạo thang chuẩn ADN 100 bp. Do đó chúng tôi đã rút gọn được thao tác thí nghiệm, hóa chất tiêu hao, chủ động được nguyên liệu đóng vai trò quan trọng trong việc hạ giá thành sản phẩm.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Từ những nghiên cứu trên, chúng tôi đưa ra một số kết luận như sau:



  1. Tạo vector tái tổ hợp pJET1.2-8×100 mang đoạn ADN 827 bp.

  2. Thiết kế thành công cặp mồi pJET-800-F/R khuếch đại đoạn 1009 bp.

  3. Chuẩn hóa thành công thành phần, điều kiện phản ứng khuếch đại và cắt không hoàn toàn đoạn 1009 bp bằng enzyme HpaII.

  4. Thiết kế thành công thang chuẩn ADN SY - 100 gồm tổ hợp băng: 106 bp/107 bp; 203 bp/211 bp; 305 bp/315 bp; 395 bp; 499 bp; 596 bp/604 bp; 698 bp/700 bp/708 bp; 802 bp/805 bp; 907 bp/909 bp; 1009 bp.

KIẾN NGHỊ

  1. Gửi thang chuẩn sản xuất tới một số phòng thí nghiệm sinh học phân tử trong nước để kiểm định chất lượng.

  2. Chuẩn hóa quy trình sản xuất thang chuẩn 100 bp trên quy mô pilot.


TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tiếng Việt

1. Phạm Anh Thùy Dương (2008), Nghiên cứu thiết kế thang chuẩn ADN chất lượng cao, Luận văn thạc sĩ khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường đại học Khoa học Tự nhiên, Hà Nội.

2. Dương Văn Hợp (2005), Nghiên cứu ứng dụng quy trình sản xuất một số chế phẩm chuyên dụng chất lượng cao dùng cho nghiên cứu sinh học phân tử, Báo cáo tổng kết Khoa học và Kỹ thuật, Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội.

3. Võ Thị Thương Lan (2007), Một số vấn đề cơ bản của sinh học phân tử, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.

4. Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2008), Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.

5. Phạm Hùng Vân (2008), PCR và real-time PCR các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp, NXB Y Học, Thành phố Hồ Chí Minh.



6. Hoàng Văn Vinh (2007), Nghiên cứu thiết kế thang chuẩn ADN bằng phương pháp tái tổ hợp, Luận văn Thạc sĩ Khoa học, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Hà Nội.

II. Tiếng Anh

  1. Abdel-fattah Y.R, Gaballa A.A, Berekkaa M.M. (2007), “Methods for Preparation of DNA Ladder using PCR and Its Optimization by Numerical Modeling Thereof”, World Intellectual Property Organization, WO/2007/016929.

  2. Bartlett J. M. S., Stirling D. (2003), Methods in Molecular Biology, Vol. 226: PCR Protocols, Second Edition, Humana Press.

  3. Bioneer Corporation (2007), AccuPrep® Gel Purification Kit.

  4. Bioneer Corporation (2007), AccuPrep® PCR Purification Kit.

  5. Cranenburgh R. M. (2004), “An equation for calculating the volumetric ratios required in a ligation reaction”, Applied Genetics and Molecular Biotechnology, 65(10), pp. 200-202.

  6. Fermentas (2006), Clone JETTM PCR Cloning Kit.

  7. Fermentas (2010-2011), FastDigest® & Conventional Restriction Enzymes.

  8. Fermentas (2006), Gene JETTM PCR Cloning Kit procedure.

  9. Glick B. R., Pasternak J. J. (2003), Molecular Biotechnology, Third Edition, American Society for Microbiology, Washington, DC 20036-2904.

  10. Hu A. W., Hartley J. L., Jordan H. J., Acid nucleic ladders, Patent No. 6924098B2, US Patent Issued on January 25, 2007.

  11. Hyman E. D., Method of making DNA ladders, Patent No. 5939293, US Patent Issued on August 17, 1999.

  12. Pingoud A., Jeltsch A. (1997), “Recognition ang cleavage of DNA by typ-II restriction endonucleases”, Eur. J. Biochem, 246, pp.1-22.

  13. QIAGEN (2006), QIAprep® Miniprep Hand book.

  14. QIAGEN (2008), QIAquick® PCR Purification Kit (50).

  15. Sambrook J., Russell D. W. (2001), Molecular Cloning, Third Edition, Volume 1 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

  16. Sambrook J., Russell D. W. (2001), Molecular Cloning, Third Edition, Volume 2 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

  17. Sambrook J., Russell D. W. (2001), Molecular Cloning, Third Edition, Volume 3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

  18. Wang T., Guo L., Zhang J. (2010), “Preparation of DNA Ladder Based on Multiplex PCR Technique”, Journal of Nucleic Acids, vol. 2010, pp. 1-3.

III. Trang Web

  1. http://ecoliwiki.net/colipedia/index.php/DH5_alpha

  2. http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_ladder

  3. http://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_enzyme

  4. http://en.wikipedia.org/wiki/Agarose_gel_electrophoresis

  5. http://en.wikipedia.org/wiki/Gel_electrophoresis

  6. http://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide

  7. http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes#BL21

  8. http://www.ebi.ac.uk/interpro/IPR0069355restriction endonuclease, type I, R subunit/Type III, Res subunit

  9. http://www.fermentas.com

  10. http://www.fermentas.com/en/products/all/dna-electrophoresis

  11. http://www.invitrogen.com

  12. http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Nucleic-Acid-Purification-and-Analysis/Nucleic-Acid-Gel-Electrophoresis/Agarose-Gel-Electrophoresis/Nuclei Acid Ladder-E-Gel® Systems & Pre-Cast Gels/DNA ladders

  13. http://www.lablife.org

  14. http://www.molecularstation.com/agarose-gel-electrophoresis

  15. http://www.molecular-plant-biotechnology.info/recombinant-DNA-technology/types-of-restriction-endonucleases

  16. http://www.neb.com

  17. http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/markers_ladders/ DNA_markers.asp

  18. http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/markers_ladders/ ladder_marker_selection_chart.asp

  19. http://www.promega.com/catalog/catalogproducts.asp

  20. http://www.roche-appied-science.com/productcatalog

  21. http://www.takara.com

  22. http://www.takara.com.cn/markers/DNA maker

  23. http://www.uoftmedstore.com




Каталог: files -> ChuaChuyenDoi
ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH
ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh
ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân
ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05
ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường

tải về 284 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:
1   2   3   4



Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2024
được sử dụng cho việc quản lý
    Quê hương
BÁO CÁO
Tài liệu