Sự sản xuất hàng hóa và dịch vụ ở quy mô công nghiệp nhờ việc sử dụng sinh vật, các hệ thống sinh học và các quá trình sinh học
Khuếch đại sản phẩm tự nối các đoạn 100 bp
tải về 284 Kb.
|
- Điều hướng trang này:
- Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Điều kiện
- Tổng thể tích 15,0
- 3.2.4. Phản ứng cắt vector pJET1.2-8×100 bằng Eco RI 3.2.4.1. Phản ứng cắt hoàn toàn
- 3.2.4.2. Phản ứng cắt không hoàn toàn
- 3.3.1. Kết quả giải trình tự vector tái tổ hợp pJET1.2-8×100
- Các băng trong thang chuẩn (bp) Tổ hợp băng (bp) Khoảng cách giữa các băng (bp)
- Enzyme Trình tự cắt Vị trí cắt tính từ đầu 5’ đoạn ADN chèn
|
3.2.2. Khuếch đại sản phẩm tự nối các đoạn 100 bp Sản phẩm phản ứng tự nối các đoạn ADN kích thước 100 bp được làm khuôn cho phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Bre-F1/R1. Bước thí nghiệm này giúp chúng tôi thu được đoạn ADN kích thước phù hợp để chuyển vào vector pJET1.2 (Fermentas) theo bộ kit “CloneJETTM PCR Cloning Kit” [12]. Thành phần phản ứng PCR sử dụng khuôn là sản phẩm của phản ứng tự nối sử dụng cặp mồi Bre-F1/R1:
3.2.3. Tách dòng vector tái tổ hợp Sản phẩm PCR được tinh sạch theo kít Bioneer [9] và được chuyển vào vector pJET1.2; vector tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. Các khuẩn lạc sàng lọc từ môi trường LB bổ sung ampicilin (50 µg/ml) được nuôi cấy riêng biệt để tách chiết plasmid. Các plasmid được kiểm tra kích thước đoạn chèn thông qua phản ứng PCR sử dụng cặp mồi pJET1.2-F/R với thành phần phản ứng như sau:
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên agarose 1% (Hình 10). 
Hình 10. Điện di sản phẩm PCR kiểm tra kích thước đoạn chèn trong plasmid của 13 khuẩn lạc. L: ADN ladder 100 bp; (-): Đối chứng âm; Số 1 đến số 13: Sản phẩm PCR kiểm tra plasmid khuẩn lạc 1 đến 13. Trong 13 khuẩn lạc được kiểm tra, có 6 khuẩn lạc (3; 4; 5; 8; 10; 11) chứa vector mang đoạn chèn 100 bp, 1 khuẩn lạc (6) chứa vector mang đoạn chèn 200 bp, 1 khuẩn lạc (1) chứa vector mang đoạn 500 bp, 5 khuẩn lạc (2; 7; 9; 12; 13) chứa vector mang đoạn chèn kích thước khoảng hơn 800 bp. Để kiểm tra số lượng các đoạn 100 bp và các vị trí cắt của EcoRI trong đoạn chèn kích thước hơn 800 bp của 5 khuẩn lạc (2; 7; 9; 12; 13), plasmid tách từ 5 khuẩn lạc này được tham gia phản ứng cắt bằng enzyme EcoRI. Các plasmid này được kí hiệu lần lượt như sau: pJET1.2-8×100-2; pJET1.2-8×100-7; pJET1.2-8×100-9; pJET1.2-8×100-12 và pJET1.2-8×100-13. Đồng thời các khuẩn lạc này được giữ giống trong -800C.
Để kiểm tra các vị trí cắt EcoRI trên đoạn ADN chèn trong các plasmid pJET1.2-8×100 của khuẩn lạc 2; 7; 9; 12; 13, plasmid của 5 khuẩn lạc này được cắt hoàn toàn bằng enzyme EcoRI. Thành phần phản ứng gồm:
Phản ứng cắt diễn ra ở 370C trong 2 giờ. Kết quả được điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 12% (Hình 11). 
Hình 11. Điện di sản phẩm cắt hoàn toàn plasmid pJET1.2-8×100 của 5 khuẩn lạc bằng enzyme EcoRI trên gel polyacrylamide 12%. L: ADN ladder 100 bp; Số thứ tự trên hình tương ứng với số thứ tự khuẩn lạc. Từ ảnh điện di cho thấy: sản phẩm cắt hoàn toàn vector cho hai băng kích thước 100 bp và 200 bp. Theo lý thuyết thì sản phẩm cắt hoàn toàn chỉ cho một băng duy nhất kích thước 100 bp. Vì đoạn ADN chèn vào vector pJET1.2 là sản phẩm tự nối các đoạn 100 bp, ban đầu chúng tôi nghi ngờ do mẫu cắt chưa hết, thí nghiệm đã được lặp lại 3 lần với lượng enzyme tăng gấp đôi, tuy nhiên kết quả đều không thay đổi. Nguyên nhân của việc xuất hiện băng 200 bp trong sản phẩm cắt hoàn toàn chỉ có thể là do có sự sai hỏng của một trong hai vị trí cắt EcoRI liền nhau.
Cả 5 khuẩn lạc 2; 7; 9; 12; 13 mà chúng tôi thu được đều mang cùng một kiểu vector pJET1.2-8×100, vì vậy chúng tôi đã sử dụng khuẩn lạc số 2 làm đại diện cho các thí nghiệm tiếp theo. Plasmid pJET1.2-8×100-2 của khuẩn lạc 2 được cắt không hoàn toàn bằng enzyme EcoRI. Phản ứng được thực hiện ở các lượng ADN khác nhau và thời gian ủ khác nhau.
Phản ứng cắt không hoàn toàn vector pJET1.2-8×100-2 bằng EcoRI sẽ tạo ra các băng mong muốn có kích thước từ 100 bp đến 800 bp (khá nhỏ so với kích thước vector). Để có thể quan sát được các băng này, lượng ADN ban đầu sử dụng là 10,0 µl (23 µg). Phản ứng được diễn ra ở 370C tại các thời gian: 20 phút, 30 phút và 40 phút, bất hoạt enzyme ở 700C trong 10 phút. Thành phần cho một phản ứng gồm:
Sản phẩm cắt được điện di kiểm tra trên agarose 2% (Hình 12). 
Hình 12. Ảnh điện di mẫu cắt không hoàn toàn plasmid pJET1.2-8×100-2 bằng EcoRI tại ba thời gian khác nhau trên agarose 2%. L: ADN ladder 100 bp; 1: Mẫu cắt 20 phút; 2: Mẫu cắt 30 phút; 3: Mẫu cắt 40 phút. Từ ảnh điện di cho thấy: mẫu cắt 20 phút (1) cho các băng mờ, lượng plasmid chưa cắt còn nhiều; mẫu cắt 30 phút (2) và 40 phút (3) lại làm lượng lớn băng ADN kích thước 800 bp bị cắt tạo băng kích thước nhỏ. Thời gian cắt 40 phút có các băng độ sáng khá đồng đều. Tuy nhiên, nhìn chung lượng ADN vẫn khá thấp, do đó dẫn đến độ sáng các băng chưa cao, chúng tôi quyết định chọn thời gian cắt 40 phút, nhưng thay đổi lượng ADN.
Sau khi đã chọn được thời điểm cắt thích hợp, chúng tôi quyết định tăng lượng ADN lên 15,0 µl (35 µg). Thành phần phản ứng gồm:
Phản ứng diễn ra ở 370C, 40 phút, bất hoạt enzyme ở 700C, 10 phút. Sản phẩm cắt được điện di trên agarose 2,5% (Hình 13). 
Hình 13. Ảnh điện di mẫu cắt plasmid pJET1.2-8×100-2 bằng EcoRI trên agarose 2,5%. L: ADN ladder 100 bp; 1: Mẫu cắt không hoàn toàn 15 µl ADN. Kết quả Hình 13 cho thấy sản phẩm cắt gồm 8 băng ADN kích thước từ 100 bp đến 800 bp sáng rõ. Sử dụng 15,0 µl (35 µg) ADN cho phản ứng cắt là tối ưu để sản phẩm cho các băng ADN rõ nét.
Thông qua hai bước kiểm tra thời gian và lượng ADN cho phản ứng cắt không hoàn toàn plasmid pJET1.2-8×100-2 bằng EcoRI, chúng tôi thiết lập thành phần phản ứng và điều kiện cắt tối ưu như sau:
Phản ứng diễn ra ở 370C, 40 phút và enzyme sau đó được bất hoạt ở 700C, 10 phút, sản phẩm được điện di kiểm tra trên agarose 2%. Như vậy, chúng tôi đã nhân dòng thành công vector pJET1.2-8×100-2 mang đoạn ADN chèn kích thước khoảng 800 bp là sản phẩm tự nối của các đoạn ADN 100 bp. Sử dụng plasmid pJET1.2-8×100-2 trong phản ứng cắt không hoàn toàn bằng enzyme EcoRI, chúng tôi thu được thang chuẩn ADN 100 bp gồm 8 băng từ 100 bp đến 800 bp. 3.3. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ
Plasmid pJET1.2-8×100-2 sau khi tách chiết và kiểm tra độ tinh sạch được giải trình tự hai chiều (Hình 14). 
Hình 14. Ảnh minh họa kết quả giải trình tự vector pJET1.2-8×100-2. (A): Giải trình tự theo chiều xuôi; (B): Giải trình tự theo chiều ngược. Khi phân tích trình tự, chúng tôi nhận thấy tính từ đầu 5’ của đoạn ADN chèn trong vector pJET1.2-8×100-2 có hiện tượng: thay thế hai nucleotide A bằng bộ ba TTC tại vị trí 24; thay thế nucleotide C bằng T ở vị trí 409 làm mất một vị trí cắt của enzyme EcoRI; thêm một nucleotide A tại vị trí 712; 15 nucleotide đứng sau vị trí cắt cuối cùng của EcoRI tại đầu 3’ là một phần của đoạn 100 bp tham gia phản ứng tự nối.
Kết quả giải trình tự hai chiều đoạn ADN chèn trong vector pJET1.2-8×100-2 cho thấy kích thước chính xác của đoạn ADN chèn là 827 bp (thay vì 800 bp như dự đoán): - Gồm 12 vị trí cắt của EcoRI, trong đó có 4 điểm mà tại đó 2 vị trí cắt của EcoRI liền kề nhau, chỉ cách nhau 2 nucleotide. - Mất một trình tự cắt của EcoRI tại vị trí 404 tính từ đầu 5’. Chính vì sự xuất hiện các vị trí cắt của enzyme liền kề nhau và mất một vị trí cắt đã tạo nên sự chênh lệch các băng ADN so với dự tính trong thiết kế. Vì vậy, thực tế chúng tôi lại thu được 31 băng với kích thước của các băng được thống kê cụ thể trong Bảng 5. Bảng 5. Tổ hợp sản phẩm cắt không hoàn toàn plasmid pJET1.2-8×100-2 bằng EcoRI.
Sự chênh lệch giữa các băng ADN trong cùng một kích thước của thang chuẩn lên tới 16 bp (ví dụ kích thước 200 bp có băng 197 bp và 213 bp). Sự chênh lệch này nhỏ và không thể phân tách trên các nồng độ gel agarose (1,7% đến 2,5%) thích hợp cho thang chuẩn ADN 100 bp [36, 49], nhưng lại có thể quan sát trên gel polyacrylamide từ 8% trở lên (Hình 15). 
Hình 15. Ảnh điện di sản phẩm cắt không hoàn toàn pJET1.2-8×100-2 bằng EcoRI trên gel polyacrylamide 8%. 1: Mẫu cắt; L: ADN ladder 100 bp. Ảnh điện di có thể quan sát rõ kích thước 100 bp và 200 bp gồm 2 băng. Vì vậy, sự chênh lệch đó có ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng thang chuẩn được sản xuất. Đồng thời, kích thước các băng của thang chuẩn 100 bp là nhỏ so với kích thước của vector pJET1.2 (2974 bp). Để có được thang chuẩn ADN 100 bp gồm các băng sáng rõ, chúng tôi phải sử dụng một lượng plasmid rất lớn (35 µg trở lên). Điều này cũng kéo theo chi phí sản xuất và giá thành sản phẩm tăng lên. Để khắc phục những khó khăn này chúng tôi quyết định lựa chọn một enzyme cắt giới hạn khác thay thế cho EcoRI. Sau khi khảo sát một số enzyme cắt giới hạn có mặt trên đoạn ADN chèn trong vector pJET1.2-8×100-2 chúng tôi nhận thấy enzyme cắt giới hạn HpaII là phù hợp.
Enzyme giới hạn HpaII có 5 vị trí nhận biết và cũng là vị trí cắt trên đoạn ADN chèn trong vector pJET1.2-8×100-2, khi cắt không hoàn toàn plasmid pJET1.2-8×100-2 bằng enzyme HpaII sẽ thu được tổ hợp 10 băng ADN như được trình bày trong Bảng 6. Bảng 6. Tổ hợp các băng ADN khi cắt không hoàn toàn plasmid pJET1.2-8×100-2 bằng enzyme HpaII.
Каталог: files -> ChuaChuyenDoi ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05 ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường tải về 284 Kb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|