Sự sản xuất hàng hóa và dịch vụ ở quy mô công nghiệp nhờ việc sử dụng sinh vật, các hệ thống sinh học và các quá trình sinh học

Hình 6. (A): ADN ladder 100 bp của một số hãng sản xuất thương mại [41]; (B): Ảnh ADN ladder 100 bp kết hợp với ADN ladder 500 bp (Fermentas) [33].

ADN ladder 100 bp thương mại hiện bán trên thị trường thường gồm dải băng kích thước rộng, bước nhảy giữa hai băng kế tiếp là 100 bp giúp thang chuẩn ADN loại này được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu khác nhau. ADN ladder 100 bp được đầu tư, sản xuất và cung ứng bởi nhiều hãng sản xuất trên thế giới [37, 47]. Từ những tài liệu mà chúng tôi có được cho thấy hầu hết thang chuẩn loại này được sản xuất nhờ áp dụng kỹ thuật PCR [7], Multiplex PCR [24], kỹ thuật ADN tái tổ hợp [17]. Giá thành ADN ladder 100 bp thương mại tương đối cao [7, 24].

Tại phòng thí nghiệm của chúng tôi thang chuẩn ADN 100 bp có nhu cầu sử dụng hàng ngày. Chúng tôi đặt mua thang chuẩn từ nước ngoài nên không chủ động được nguồn cung cấp, phụ thuộc thời gian vận chuyển, giá thành cao do phải chịu thêm thuế nhập khẩu và chi phí vận chuyển. Xuất phát từ nhu cầu sử dụng và những khó khăn khi đặt hàng chúng tôi tiến hành đề tài “Thiết kế thang chuẩn ADN” bước nhảy 100 bp.

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN LIỆU

1. Vector pJET1.2 là vector tách dòng sản phẩm PCR, nằm trong bộ kit “CloneJET^TM PCR Cloning Kit” của hãng Fermentas - Đức [12] (Phụ lục 01).

2. Vector pGEX-4T-1-Bre là vector pGEX-4T-1 (Phụ lục 02) mang đoạn ADN kích thước 114 bp, được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

3. Vector pJET1.2-8×100 là vector pJET1.2 mang các đoạn ADN kích thước 100 bp tự nối.

Cặp mồi Bre-F1/Bre-R1 được thiết kế để nhân bản đoạn ADN kích thước 108 bp từ đoạn ADN 114 bp trong vector pGEX-4T-1-Bre.

Cặp mồi pJET1.2-F/pJET1.2-R thiết kế dựa trên trình tự của vector pJET1.2, cung cấp theo “CloneJET^TM PCR Cloning Kit” [12].

Cặp mồi pJET-800-F/pJET-800-R được thiết kế để khuếch đại đoạn ADN kích thước 1000 bp từ vector pJET1.2-8×100.

Các mồi được cung cấp bởi hãng Bioneer - Hàn Quốc và IDT - Mỹ. Trình tự các cặp mồi được thể hiện trong Bảng 3.

Bảng 3. Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu.

• 
  Chủng E.coli DH5α
  

- Đột biến bất hoạt gen mã cho endonuclease nội bào, giúp bảo vệ plasmid.

- Đột biến loại bỏ gen mã cho enzyme EcoKI sẽ bảo vệ các vị trí cắt của enzyme này trên phân tử ADN khi chúng không được methyl hóa.

- Mang gen Δ(lacZ)M15 mã cho thụ thể nhận alpha (alpha acceptor) cần thiết cho quá trình sàng lọc xanh - trắng trên nhiều hệ vector.

Chủng E.coli DH5α được chúng tôi sử dụng trong biến nạp vector pJET1.2-8×100.

• 
  Chủng E.coli BL21(DE3)
  

- Đột biến gen mã cho protease ngoài màng tế bào, giúp bảo vệ các protein được biểu hiện khỏi sự phân giải protein.

- Loại bỏ gen mã cho protease lon một enzyme làm giảm sút protein vi khuẩn và ức chế sự phân chia tế bào cho tới khi quá trình sửa chữa nhiễm sắc thể được hoàn thành.

Nghiên cứu của chúng tôi sử dụng nguyên liệu ban đầu là chủng E.coli BL21 (DE3) mang vector pGEX-4T-1-Bre.

• 
  Hóa chất
  

- dNTP mix 2 mM (Sigma - Mỹ, Takara - Nhật Bản);

- Các enzyme cắt giới hạn (Fermentas - Đức, New England Biolabs - Anh);

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Lubertini broth (LB) gồm các thành phần: 1% trypton; 0,5% cao nấm men ; 0,5% NaCl; 1,2% agar (môi trường đặc) [23];

- Các kit tách dòng gen của Fermentas - Đức [12, 14], tinh sạch sản phẩm PCR và tinh sạch ADN của Bioneer - Hàn Quốc [9, 10], tinh sạch plasmid và ADN của Qiagen - Đức [19, 20];

- Thang chuẩn 100 bp và 1 kb của Takara - Nhật Bản, Fermentas - Đức, New England Biolabs - Anh;

- Các hóa chất khác đều đạt độ tinh sạch cao dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử.

• 
  Trang thiết bị
  

2.2. SƠ ĐỒ THÍ NGHIỆM

Toàn bộ quá trình nghiên cứu được tóm tắt trong Hình 7.

Hình 7. Sơ đồ nghiên cứu thiết kế thang chuẩn ADN SY - 100.

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Phương pháp tách chiết plasmid từ vi khuẩn

Plasmid tách chiết từ tế bào vi khuẩn theo hai phương pháp:

• 
  Tách chiết plasmid sử dụng môi trường kiềm có SDS [21]
  

+ Thêm 100 µl dung dịch I (50 mM Tris-HCl, pH 8, glucose 50 mM, 10 mM EDTA pH 8), vortex tan cặn, ủ nhiệt độ phòng 10 phút

+ Thêm 200 µl dung dịch II (0,2 N NaOH, 1% SDS), đảo đều, ủ đá 3 phút

+ Thêm 150 µl dung dịch III (3 M potassium acetate, pH 5), đảo đều, ủ đá 5 phút

+ Ly tâm 13000 vòng/phút ở 4⁰C trong 20 phút, thu dịch trong

+ Bổ sung 1 thể tích Phenol : Chloroform : Isoamyl (25 : 24 : 1), vortex đều

+ Ly tâm 13000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, thu dịch pha trên

+ Bổ sung thêm 0,6 lần thể tích Isopropanol, ủ nhiệt độ phòng 20 phút

+ Ly tâm 13000 vòng/phút ở 4⁰C trong 20 phút, thu tủa

+ Để khô tủa hoàn toàn, hòa với nước khử trùng hoặc TE 1X, pH 8

Mẫu plasmid được bảo quản ở -20⁰C.

• 
  Tinh sạch plasmid sử dụng Kit của Qiagen [19]
  

Một phản ứng nối các đoạn ADN thường diễn ra trong tổng thể tích từ 10 - 20 µl ở 4⁰C đến 37⁰C, sử dụng enzyme T4 ADN ligase, dung dịch đệm chứa Mg²⁺ và ATP [11, 14]. T4 ADN ligase tham gia xúc tác hình thành liên kết phosphodiester giữa các đầu tận cùng (có thể là đầu bằng hoặc đầu so le) của các đoạn ADN [11].

Trong nghiên cứu của chúng tôi, đoạn ADN kích thước 108 bp khuếch đại từ phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Bre-F1/R1 sẽ được cắt hoàn toàn với EcoRI (GˇAA TTC) tạo đầu so le. Sản phẩm phản ứng cắt là các đoạn 100 bp sẽ tham gia phản ứng tự nối diễn ra ở 14⁰C qua đêm. Các bước làm được chúng tôi tuân thủ theo quy trình phản ứng nối tham khảo trong “CloneJET^TM PCR Cloning Kit” [12], “Gene JET^TM PCR Cloning Kit procedure” [14] và “FastDigest^® & Conventional Restriction Enzymes” [13].

2.3.3. Biến nạp theo phương pháp sốc nhiệt

Vector pJET1.2 mang đoạn chèn được biến nạp vào tế bào E.coli DH5α theo phương pháp sốc nhiệt. Tế bào khả biến DH5α đã được xử lý với CaCl₂ giúp màng tế bào trở nên xốp hơn làm tăng khả năng tiếp nhận ADN. Biến nạp theo phương pháp sốc nhiệt gồm các bước sau:

• 
  Tạo tế bào khả biến [21]
  

• 
  Nuôi 50 ml dung dịch tế bào E.coli DH5α trong môi trường LB lỏng tại 37⁰C, lắc 200 vòng/phút, tới khi dung dịch tế bào có giá trị mật độ quang (Optical Density - OD) ở bước sóng 600 nm nằm trong khoảng từ 0,4 - 0,6
  
• 
  Ủ mẫu trên đá khoảng 30 phút
  
• 
  Ly tâm thu cặn tế bào
  
• 
  Hòa cặn trong 15 ml dịch chứa MgCl₂ 80 mM và CaCl₂ 20 mM cho đến khi tạo dịch đồng nhất. Ly tâm thu cặn tế bào
  
• 
  Hòa tan cặn trong CaCl₂ 100 mM tạo dịch đồng nhất, sao cho mật độ tế bào có giá trị OD 600 bằng 1
  
• 
  Ủ mẫu ở 4⁰C qua đêm
  
• 
  Bổ sung glycerol 100% đến nồng độ 15%
  
• 
  Chia hỗn hợp tế bào khả biến vào các ống eppendorf 1,5 ml, bảo quản ở -80⁰C.
  

• 
  Biến nạp [15, 21]:
  

• 
  Lấy tế bào khả biến từ -80⁰C để cùng hỗn hợp nối ADN trên đá 5 phút
  
• 
  Bổ sung 5 µl sản phẩm nối vào ống tế bào khả biến, búng nhẹ, ủ trên đá 20 phút
  
• 
  Sốc nhiệt tại 42⁰C trong 90 giây, để ngay lại trên đá 2 phút
  
• 
  Bổ sung 1 ml LB lỏng, ủ 37⁰C trong 20 phút, sau đó lắc 200 vòng/phút ở 37⁰C trong 30 phút
  
• 
  Ly tâm hỗn hợp 6000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, giữ lại 100 µl dịch và cặn
  
• 
  Hòa cặn tạo dịch đồng nhất trong 100 µl còn lại, đem trải trên đĩa thạch LB có kháng sinh
  
• 
  Nuôi cấy vi khuẩn ở điều kiện vô trùng, 37⁰C qua đêm.
  

Trong nghiên cứu của chúng tôi, có ba cặp mồi được sử dụng cho các mục đích thí nghiệm khác nhau:

• 
  Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Bre-F1/R1 khuếch đại đoạn 108 bp dựa trên trình tự đoạn 114 bp trong vector pGEX-4T-1-Bre.
  
• 
  Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi pJET1.2-F/R và khuôn là vector tái tổ hợp pJET1.2-8×100.
  
• 
  Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi pJET-800-F/R với khuôn là vector pJET1.2-8×100 khuếch đại đoạn 1000 bp được cắt không hoàn toàn bằng HpaII tạo thang chuẩn 100 bp.
  

Nồng độ và độ tinh sạch của ADN trong các thí nghiệm được xác định bằng quang phổ kế, với độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm (là độ hấp thụ của ADN) và 280 nm (là độ hấp thụ của protein). Nồng độ ADN được tính theo công thức:

[ADN ] = A₂₆₀ × n × 50 (µg/ml)

Trong đó:

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hai enzyme cắt giới hạn là EcoRI (GˇAA TTC) và HpaII (CˇCGG) (Fermentas).

- Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi Bre-F1/R1 có kích thước 108 bp sẽ được cắt hoàn toàn bằng enzyme EcoRI (GˇAA TTC) tạo đầu dính.

- Vector pJET1.2-8×100 mang đoạn ADN kích thước mong muốn sẽ được cắt không hoàn toàn bằng enzyme EcoRI (GˇAA TTC) kiểm tra vị trí cắt.

- Sản phẩm PCR kích thước 1000 bp được cắt không hoàn toàn bằng enzyme HpaII (CˇCGG) tạo thang chuẩn ADN SY - 100.

2.3.7. Tinh sạch sản phẩm phản ứng PCR

Tùy mục đích trong từng thí nghiệm mà sản phẩm PCR của chúng tôi được tinh sạch theo hai cách khác nhau.

- Sản phẩm PCR sử dụng khuôn là sản phẩm tự nối các đoạn 100 bp sẽ được điện di lượng lớn trên gel agarose. Sử dụng bộ kit của Bioneer với các bước tiến hành được hướng dẫn cụ thể trong “AccuPrep^® Gel Purification Kit” [9] để tinh sạch ADN.

- Sản phẩm phản ứng PCR kích thước 1000 bp và các đoạn ADN của thang chuẩn tạo ra trong phản ứng cắt không hoàn toàn sẽ được loại muối, dimer nhờ bộ kít tinh sạch sản phẩm PCR của Qiagen. Các bước tiến hành và những lưu ý quan trọng được hướng dẫn chi tiết trong “QIAquick^® PCR Purification Kit (50)” [20].

Điện di (electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử là kỹ thuật để phân tách các phân tử ADN, ARN hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện (isoelectric point) [29]. Kỹ thuật điện di sử dụng:

- Một dung dịch đệm (buffer) để dẫn điện và tạo điện trường đều.

- Một bản gel đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử. Có hai loại gel được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật điện di ADN là gel agarose và polyacrylamide. Gel cấu tạo bởi các chuỗi cao phân tử (polymer) được liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lưới với kích thước các mắt lưới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phân tử (agarose, polyacrylamide) và phản ứng tạo liên kết chéo [29].

- Các chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide, bạc, đồng vị phóng xạ,…) để phát hiện vị trí các phân tử ADN trên gel sau khi điện di [3, 28].

Do điện tích âm của khung phosphate (phosphate backbone), các đoạn ADN dịch chuyển từ điện cực âm sang cực dương (qua các lỗ gel trong phương pháp điện di trên gel). Các đoạn ADN kích thước nhỏ có thể dễ dàng di chuyển qua các lỗ gel vì vậy dịch chuyển tới cực dương nhanh hơn các đoạn ADN kích thước lớn [16].

3.1. KHUẾCH ĐẠI VÀ TẠO ĐOẠN ADN CÓ KÍCH THƯỚC 100 bp

Phân tích trình tự đoạn ADN kích thước 114 bp trong vector pGEX-4T-1-Bre (Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội), chúng tôi nhận thấy đoạn 114 bp mang một vị trí cắt của enzyme giới hạn EcoRI (GˇAA TTC) tại nucleotide thứ ba tính từ đầu 5’ của đoạn chèn. Sử dụng phần mềm thiết kế mồi FastPCR và trình tự đoạn ADN kích thước 114 bp trong vector pGEX-4T-1-Bre, chúng tôi thiết kế cặp mồi Bre-F1/R1 mang vị trí nhận biết của EcoRI ở đầu 5’ (Hình 8). Sản phẩm phản ứng PCR sử dụng plasmid pGEX-4T-1-Bre làm khuôn với mồi Bre-F1/R1 là đoạn ADN kích thước 108 bp với hai đầu có vị trí của enzyme EcoRI. Do đó, đoạn 108 bp sau khi được cắt hoàn toàn bằng EcoRI sẽ thu được một đoạn ADN kích thước 100 bp.

Hình 8. Sơ đồ minh họa thiết kế cặp mồi Bre-F1/R1 dựa trên trình tự đoạn 114 bp trong vector pGEX-4T-1-Bre.

• 
  Phản ứng PCR khuếch đại đoạn ADN kích thước 108 bp
  

Hình 9. Điện di sản phẩm PCR đoạn 108 bp trên agarose 2%. 1: ADN Ladder 100 bp; 2: Sản phẩm PCR kích thước 108 bp.

Băng điện di sản phẩm PCR sáng rõ chứng tỏ:

- Cặp mồi Bre-F1/R1 được thiết kế có tính đặc hiệu cao.

- Đã khuếch đại thành công lượng lớn đoạn ADN kích thước 108 bp.

3.1.2. Tạo đoạn 100 bp bằng phản ứng cắt với EcoRI

Để thu được lượng lớn đoạn ADN kích thước 100 bp, đoạn ADN kích thước 108 bp được cắt hoàn toàn bằng enzyme EcoRI. Phản ứng gồm thành phần như sau:

3.2. TẠO VECTOR TÁI TỔ HỢP

Lượng lớn đoạn ADN kích thước 100 bp được sử dụng cho phản ứng tự nối nhằm thu được đoạn ADN kích thước lớn, mang các vị trí cắt của enzyme EcoRI cách đều 100 bp. Phản ứng tự nối các đoạn 100 bp diễn ra ở 14⁰C qua đêm với thành phần phản ứng gồm:

Đệm 10X	1,5 µl
ADN	3,0 µl
T4 ADN ligase 5 u/µl	1,0 µl
Thêm nước để có tổng thể tích	15,0 µl

Каталог: files -> ChuaChuyenDoi
ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH
ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh
ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân
ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05
ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường

tải về 284 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn: