MỤc lục danh mục từ viết tắt danh mục bảng biểu danh mục hình vẽ MỞ ĐẦU

Ảnh hưởng của pH có ý nghĩa rất lớn đối với sắc ký trao đổi ion và cặp ion, tuy nhiên trong một số trường hợp hấp thụ pha ngược yếu tố này cũng thể hiện rất rõ, nhất là pha động có chứa nước.

(a)	(b)
(c)	(d)
(e)	Hình 3.7: Sắc đồ sắc ký ở pH khác nhau a. pH = 3,5 b. pH = 4,0 c. pH = 4,5 d. pH = 5,0 e. pH = 5,5

Nhìn vào bảng kết quả và pic sắc ký ở khoảng pH đã khảo sát chúng tôi thấy: pH càng cao thì khả năng tách 2 chất SMX và SDO kém (pH=5,5). pH thấp thì thời gian rửa giải lâu (pH=3,5). Tại giá trị pH = 4,5 các pic sắc ký có sự tách biệt rõ rệt hơn, pic cân đối và không mất nhiều thời gian xuất hiện pic sắc ký. Mặt khác, dựa trên đồ thị nhận thấy ở pH này có sự khác nhau rõ rệt về hệ số dung tích cuả các chất phân tích. Như vậy, pH của pha động được chọn là 4,5 cho các thí nghiệm tiếp theo.

Tỉ lệ thành phần dung môi tạo ra pha động có ảnh hưởng đến quá trình rửa giải các chất mẫu ra khỏi cột tách. Khi tỉ lệ thành phần pha động thay đổi thì lực rửa giải của pha động thay đổi, tức làm thay đổi thời gian lưu của chất phân tích ra khỏi cột và do đó làm thay đổi hệ số dung tích của chất phân tích.

(a)	(b)
(c)	(d)

a. 15%ACN – 85% đệm b. 20%ACN – 80% đệm

c. 25%ACN – 75% đệm d. 30% ACN – 70% đệm

Khi tăng dần tỉ lệ thành phần trong pha động thì thời gian rửa giải chất ra khỏi cột nhanh hơn, hệ số dung tích gần nhau hơn, trên sắc đồ các chân pic sắc ký lại không tách biệt rõ ràng, ảnh hưởng đến diện tích pic sắc ký (ví dụ như tỉ lệ 30% ACN – 70% đệm). Tuy nhiên, nếu tỷ ACN thấp quá thì sẽ mất rất nhiều thời gian để rửa giải chất phân tích. Vì vậy, chúng ta nên chọn tỷ lệ sao cho thời gian rửa giải không quá nhanh, không quá chậm, pic rõ ràng. Với những nhận xét như vậy chúng tôi lựa chọn tỉ lệ pha động gồm 20% ACN – 80% đệm là tỉ lệ phù hợp cho các thí nghiệm tiếp theo.

Cùng với yếu tố thành phần pha động, thì tốc độ pha động khi chạy sắc ký cũng ảnh hưởng không ít đến kết quả tách sắc ký. Tốc độ pha động cũng là yếu tố quyết định đến quá trình rửa giải các chất trong cột sắc ký vì nó ảnh hưởng đến quá trình thiết lập cân bằng của chất tan giữa hai pha tĩnh và pha động. Tốc độ pha động quá nhỏ sẽ gây ra hiện tượng doãng pic, thời gian rửa giải các chất lớn làm giảm tính kinh tế của phương pháp. Nhưng tốc độ pha động quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp mẫu kịp tách ra khỏi nhau, dẫn đến hiện tượng chồng, chen lấn pic. Vì vậy cần chọn được tốc độ pha động phù hợp.

Đối với một hệ pha tĩnh và thành phần pha động đã lựa chọn thì khả năng tách các chất phụ thuộc vào tốc độ pha động. Đối với một cột tách xác định thì sẽ có một tốc độ tối ưu. Tiến hành khảo sát tốc độ pha động trong khoảng từ 0,6 – 1,4 ml/phút với các điều kiện tối ưu tiến hành khảo sát ở trên (dung dịch đệm axetat có pH=4,5; nồng độ đệm 10mM; thành phần pha động gồm 20% ACN- 80% đệm), kết quả thu được được trình bày trong bảng 3.6, hình 3.10 và hình 3.11:

Bảng 3.6: Diện tích pic của các chất phân tích phụ thuộc vào tốc độ pha động

F (ml/phút)	Diện tích pic (mAu.s)
	SGU	MTD	SMP	SDO	SMX
0,6	534536	133986	638073	673204	595306
0,8	400143	100195	474279	502574	447284
1,0	345287	81369	392010	412267	367271
1,2	294225	66042	312130	329778	293399
1,4	274280	62526	290596	305183	272451

Qua bảng kết quả và đồ thị nhận thấy khi tăng tốc độ pha động thì diện tích pic sắc ký của các SAs giảm. Dựa vào sắc đồ nhận thấy khi tăng tốc độ pha động qua cột tách thì thời gian lưu của các SAs giảm, pic sắc ký xuất hiện gần nhau hơn. Tại tốc độ 1ml/phút cho khả năng tách khá tốt và không mất nhiều thời gian tách chất ra khỏi cột. Do đó tốc độ pha động là 1ml/phút được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.

(a)	(b)
(c)	(d)
Hình 3.11: Sắc đồ tốc độ khác nhau của pha động a. 0,6 ml/phút. b. 0,8 ml/phút c. 1,0 ml/phút d. 1,2 ml/phút e. 1,4 ml/phút	(e)

Từ các điều kiện đã tối ưu ở trên, tiến hành kháo sát khoảng tuyến tính của phép đo với các điều kiện sau:

Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.7:

Dựa vào số liệu trên, sử dụng phần mền Orgirin version 6.0 của hãng Microcal xây dựng đường chuẩn. Kết quả được trình bày trong hình 3.12:

(a)	(b)
(c)	(d)
(e)

1. 
   Đường chuẩn của Sulfaguanidine (SGU)
   
2. 
   Đường chuẩn của Metronizazol(MTD)
   
3. 
   Đường chuẩn của Sulfamethoxypiridazine (SMP)
   
4. 
   Đường chuẩn của Sulfadoxine (SDO)
   
5. 
   Đường chuẩn của Sulfamethoxazone (SMX)
   

Tuy nhiên phương pháp tiến hành sắc ký để xây dựng đường chuẩn của các SAs có thể mắc sai số hệ thống, do đó để kiểm tra xem phương pháp sắc ký có mắc sai số hệ thống hay không, tiến hành kiểm tra các giá trị a của phương trình hồi quy và giá trị 0 với độ tin cậy thống kê là P=0,95

Phương trình hồi quy đầy đủ của đường chuẩn có dạng:

y = ( a ± t_{(P, f)}.S_a) + (b± t_{(P, f)}.S_b).x với P =0,95 ; f = n-2

Nếu xem a≈0 thì phương trình được viết thành phương trình y= b^’x.

Thay các giá trị y_i và x_i vào phương trình y= b^’x ta sẽ có các giá trị b^’_i và tính: _^’= _ . Phương trình đầy đủ a≈0 có dạng: Y= (_^’ ± t._ )x.

Từ kết quả tính toán nhận thấy các giá trị F_tínhbảng, như vậy sự khác nhau giữa giá trị a và giá trị 0 là không có ý nghĩa, hay có thể coi a=0. Như vậy phương pháp tiến hành sắc ký không mắc sai số hệ thống. Vì vậy với mục tiêu nghiên cứu là các mẫu thực phẩm nên chúng tôi tiến hành chọn các điều kiện phân tích này.